一、背景及概述
沙門氏菌是一大屬具有共同特性的腸道桿菌。因美國病理學(xué)家沙門(Daniel Elmer Salmon，1850—1914)最早發(fā)現(xiàn)，故名。有數(shù)千種，按抗原成分可分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組，除傷寒和副傷寒甲、乙桿菌引起人類疾病外，大多僅能引起家畜、鼠類和禽類等動物的疾病，但有時(shí)人食入此菌污染的食物也可引起食物中毒。沙門氏菌屬致食物中毒者，主要有豬霍亂桿菌、鼠傷寒桿菌、紐波沙門氏菌等。此類細(xì)菌可在水、乳及肉類等食品中生存數(shù)月，特別是病死的牲畜肉。但健康的畜禽腸內(nèi)亦有此種細(xì)菌。發(fā)病季節(jié)多在夏、秋兩季。沙門氏菌引起的食物中毒，多由于對帶菌的食物加熱不夠，處理不當(dāng)而引起。
二、檢測方法
在世界各國各類細(xì)菌性的食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒高居前列。人畜感染沙門氏菌后可能加重病癥或加大死亡率，也可能會降低動物繁殖力，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重威脅人民群眾的身體健康和畜牧業(yè)的健康發(fā)展，對其防治歷來是公共衛(wèi)生的一項(xiàng)重要課題。快速、準(zhǔn)確、簡便地檢測出沙門氏菌,在醫(yī)療衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、動物疫病監(jiān)測等方面具有重要的意義。
檢測沙門氏菌一直以傳統(tǒng)檢測方法為主，非選擇性和選擇性增菌、可疑細(xì)菌分離等常規(guī)方法雖然經(jīng)典可靠，但程序復(fù)雜、十分繁瑣，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且敏感性和特異性較差，漏檢率較高。而免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)等方法需要使用指定的儀器設(shè)備、具備相應(yīng)的試驗(yàn)條件和技能，難以在基層推廣。膠體金標(biāo)記免疫分析法是近年興起并快速發(fā)展的一種新型分析技術(shù)，其特點(diǎn)是快捷簡便、成本低、無污染 且無需培訓(xùn)，非常適合現(xiàn)場檢測。與ELISA相比，具有顯色時(shí)間短、無需儀器等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價(jià)值。
1、一種沙門氏菌的檢測試紙及其制備方法
CN201610318472.0采用豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌免疫兔制得的兔抗沙門氏菌多抗血清，研制膠體金試紙條用于臨床快速檢測。該檢測試紙，包括底板，所述底板具有端和第二端，并且沿所述端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述膠體金墊上含有膠體金標(biāo)記的沙門氏菌抗體，所述硝酸纖維素膜上進(jìn)一步形成有檢測線和對照線，所述檢測線由能與沙門氏菌結(jié)合的沙門氏菌抗體劃膜制成，所述對照線由能與沙門氏菌抗體結(jié)合的羊抗兔抗體劃膜制成。
其中，所述膠體金標(biāo)記的沙門氏菌抗體通過以下方法制得：取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入1單位體積的1％氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-10min，然后加入3單位體積的1％的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液；調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至8.0；在膠體金溶液中加入沙門氏菌抗體至沙門氏菌抗體的濃度為8-11μg/mL(9.6μg/mL)，混勻后加入10％PEG20000至PEG20000的濃度為1％，獲得純化前的膠體金標(biāo)記的沙門氏菌抗體；將膠體金標(biāo)記的沙門氏菌抗體以2000r/min，4℃離心20min，棄去沉淀；將上一步所得上清以10000r/min，4℃離心30min，棄去上清；用0.05mol/L的TBS(內(nèi)含1％BSA，0.05％NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體 積，重復(fù)前兩步的離心2～3次，將沉淀溶于1/10TBS(內(nèi)含1％BSA,0.05％NaN3)中至純化前原體積，4℃保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標(biāo)記的沙門氏菌抗體。把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37℃烘干。
其中，設(shè)置檢測線和對照線的硝酸纖維素膜是將沙門氏菌抗體稀釋為2mg/mL，羊抗兔抗體稀釋為2mg/mL，并分別以1μL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上進(jìn)行劃膜，劃膜后烘干即得。
用該試紙檢測沙門氏菌的方法，其包括以下步驟：
a)對待測樣品進(jìn)行預(yù)處理；
b)將預(yù)處理獲得的待測樣品以前述的檢測試紙進(jìn)行檢測；
其中，步驟a)為：
a-1)將待測樣品勻漿，并加入緩沖蛋白胨水中，混勻后37℃培養(yǎng)8-18h；
a-2)取步驟a-1)培養(yǎng)液1ml-10ml，加入四硫酸鈉煌綠增菌液中42℃培養(yǎng)18-24h；
a-3)取步驟a-2)培養(yǎng)液1ml-10ml，加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中37℃培養(yǎng)18- 24h；
本方法建立的沙門氏菌抗原膠體金試紙條具有很強(qiáng)的便捷性和實(shí)用性。本方法兼有免疫反應(yīng)和色譜層析的優(yōu)點(diǎn)，無需設(shè)備、操作簡單，時(shí)間短、效率高，特異性強(qiáng)、靈敏度高，穩(wěn)定性較好。與增菌培養(yǎng)基配合使用，即可作為沙門氏菌監(jiān)測和診斷的常規(guī)手段，具有很強(qiáng)的推廣和應(yīng)用價(jià)值。目前國外沙門氏菌膠體金試紙條檢測靈敏度能達(dá)到1.07×107～1.07 ×108cfu/ml，國內(nèi)試紙條靈敏度可達(dá)1.07×106～1.07×107cfu/ml，本實(shí)驗(yàn)制備的試紙條靈敏度能達(dá)到1.07×107cfu/ml，且特異性良好。在檢測時(shí)無須樣品預(yù)處理，可以直接使用前增菌培養(yǎng)基如緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫酸鈉煌綠增菌液 (TTB)等，將增菌后的樣品滴加到試紙條的樣品區(qū)即可。減少了繁瑣的試劑稀釋、配制等步驟，結(jié)果直觀易判定，即拆即用，非專業(yè)人員也可操作。試紙條4℃或37℃存放5個(gè)月,檢測結(jié)果穩(wěn)定。通過對實(shí)驗(yàn)室周邊超市和菜市場的豬肉、雞肉和雞蛋等隨機(jī)采樣檢測，結(jié)果均為陰性，說明市場上抽檢的肉樣和雞蛋沒有受到沙門氏菌污染。
2、檢測樣品中沙門氏菌活菌體的方法
CN201310583375.0提供了一種檢測樣品中沙門氏菌活菌體的方法，該方法包括：
（1）將能夠特異地與沙門氏菌活菌體結(jié)合的抗體偶聯(lián)在磁球上，得到免疫磁球；所述能夠特異地與沙門氏菌活菌體結(jié)合的抗體不能與死菌體結(jié)合；
（2）將免疫磁球與液體形式的待測樣品進(jìn)行混合，得到混合后的物料；混合的條件使得當(dāng)待測樣品中存在沙門氏菌活菌體時(shí)，免疫磁球能夠特異性地吸附沙門氏菌活菌體；
（3）將所述混合后的物料置于分選磁場中以固定免疫磁球，并洗脫未吸附在免疫 磁球上的物質(zhì)，得到洗脫后的免疫磁球；
（4）將吸附在免疫磁球上的物質(zhì)進(jìn)行提取DNA的操作，得到模板樣品；
（5）使用針對所述沙門氏菌活菌體的特異性引物對模板樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的目的片段的含量判斷待測樣品中的沙門氏菌活菌體的含量。
3、肉類中沙門氏菌含量的檢測方法
CN201610194726提供一種肉類中沙門氏菌含量的檢測方法，步驟如下：
1)樣品制備，稱取適量肉類樣品，使用12-15倍的生理鹽水均質(zhì)拍打15-20min，并 在4000-5000rmp下離心分離10-15min，過濾，取上層清液，將殘?jiān)俅渭尤?-10倍的生 理鹽水均質(zhì)拍打15-20min，并在4000-5000rmp下離心分離10-15min，過濾，取上層清液， 合并兩次的上層清液，獲得上層總液，備用；
2)空白樣品制備，稱取適量不含沙門氏菌的空白肉類樣品，按照步驟1)，獲取空白上層總液，備用；
3)獲取八份不同已知濃度的沙門氏菌溶液，取個(gè)濃度沙門氏菌菌液用無菌生理 鹽水稀釋103、104、105、106、107、108倍，各取200μL沙門氏菌的稀釋液分別注入到12 個(gè)培養(yǎng)皿中(每個(gè)稀釋倍數(shù)做平行樣)，將各個(gè)培養(yǎng)皿中的稀釋液分別涂布于LB平板上， 于35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,計(jì)數(shù)每個(gè)平板上的可疑菌落數(shù),挑取可疑菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定驗(yàn)證后，得到1個(gè)已知濃度的沙門氏菌溶液。以同樣的步驟對第二個(gè)濃度進(jìn)行培養(yǎng)分析，以此類推得到多份不同已知濃度的沙門氏菌溶液；
4)已知濃度樣品的制備，稱適量步驟2)制備的空白上層總液，均分為八份，并分別加入同等體積的步驟3)制備的已知濃度的沙門氏菌溶液，獲得八份已知濃度樣品；
5)確定沙門氏菌與摻硼金剛石膜電極響應(yīng)電流的依從關(guān)系，采用CHI660D電化學(xué)工作站用電化學(xué)計(jì)時(shí)電流的方法快速檢測沙門氏菌的濃度，以摻硼金剛石膜電極為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，設(shè)置工作電極的檢測電位為0.9～1.15V，電解池中為pH7.2～7.6的磷酸-磷酸鹽緩沖溶液；將上述步驟4)獲得的八份已知濃度樣品逐一進(jìn)樣，記錄每次進(jìn)樣時(shí)摻硼金剛石膜電極的響應(yīng)電泳的電流值，根據(jù)全部進(jìn)樣的沙門氏菌液濃度和與其對應(yīng)響應(yīng)電流的電流值作曲線，得到響應(yīng)電流-沙門氏菌濃度曲線，該曲線為一直線，確定沙門氏菌與摻硼金剛石膜電極響應(yīng)電流的依從關(guān)系為線性關(guān)系；
6)待測樣品的檢測，稱取待測肉類樣品，按照步驟1)，獲取待測上層總液，將待測上層總液進(jìn)樣，記錄摻硼金剛石膜電極的響應(yīng)電泳的電流值，結(jié)合步驟5)獲得的響應(yīng)電流-沙門氏菌濃度曲線，得出待測肉類樣品中的沙門氏菌濃度。
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