一、背景
人膽囊上皮細(xì)胞是膽囊內(nèi)壁的細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)分泌黏液和吸收膽汁中的水分和電解質(zhì)。膽囊是一個(gè)小型的囊狀器官，位于肝臟下方，與肝臟通過膽管相連。膽囊的主要功能是儲存和濃縮膽汁，以幫助消化脂肪。
二、人膽囊上皮細(xì)胞具有以下特點(diǎn)
形態(tài)特征：人膽囊上皮細(xì)胞呈多角形或長方形，具有多個(gè)突起，核較大，核質(zhì)比高。
生長特性：人膽囊上皮細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，可以在體外培養(yǎng)并傳代。
功能特性：人膽囊上皮細(xì)胞具有分泌黏液和吸收膽汁中的水分和電解質(zhì)的功能。此外，它們還參與膽汁的合成和分泌調(diào)節(jié)。
人膽囊上皮細(xì)胞在醫(yī)學(xué)研究中具有重要應(yīng)用價(jià)值。例如，可以通過體外培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞，研究其分泌功能、增殖特性以及與疾病的關(guān)系。此外，還可以利用人膽囊上皮細(xì)胞進(jìn)行藥物篩選和毒性評價(jià)等實(shí)驗(yàn)。
三、人膽囊上皮細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇人膽囊上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)人膽囊上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)人膽囊上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
人膽囊上皮細(xì)胞可以用于納米細(xì)菌對人膽囊結(jié)石形成的影響和機(jī)制探討：
在成功分離、培養(yǎng)人膽囊上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，研究納米細(xì)菌對人膽囊上皮細(xì)胞的侵襲作用。
方法：尋找適宜的方法和合適的體外生長條件，行體外分離、培養(yǎng)及鑒定人膽囊上皮細(xì)胞。然后將實(shí)驗(yàn)分為兩組，第一組將納米細(xì)菌菌株Se90和人膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)，第二組為膽囊上皮細(xì)胞爬片空白對照組。光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌攻擊后人膽囊上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；使用四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)檢測被攻擊后細(xì)胞的存活和生長情況；使用免疫熒光染色觀察不同時(shí)間點(diǎn)納米細(xì)菌于上皮細(xì)胞的空間位置關(guān)系；透射電鏡下觀察被納米細(xì)菌攻擊后的膽囊上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
結(jié)果：使用鈍性刮擦法，置于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，成功地進(jìn)行了人膽囊上皮細(xì)胞的分離和體外原代培養(yǎng)，并理想貼壁，制作了細(xì)胞爬片。納米細(xì)菌菌株Se90與人膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)后，光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌侵襲細(xì)胞爬片后的情況。隨著時(shí)間推移，被攻擊的膽囊上皮細(xì)胞逐漸出現(xiàn)水腫，分離，隨后細(xì)胞破碎，胞核溶解消失，此過程中未發(fā)現(xiàn)明顯凋亡小體形成。
將納米細(xì)菌和膽囊上皮細(xì)胞爬片混合培養(yǎng)，檢測不同時(shí)間含不同濃度納米細(xì)菌混合培養(yǎng)液的上清液中四唑鹽(MTT)的值，比較48和72、小時(shí)MMT結(jié)果，稍高濃度組(OD=0.02)吸光度值均明顯低于低濃度組的吸光度值(P＜0.01)；在72小時(shí)低濃度組(OD=0.005)比對照組吸光度低，比較差異具有顯著性(P＜0.01)，而在48小時(shí)該組與對照組比較，差異無顯著性。
免疫熒光染色顯示，納米細(xì)菌可以在較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞中，且隨著時(shí)間的推移，進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌逐漸增多，直至進(jìn)入?yún)R集于胞核。在電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，膽囊上皮細(xì)胞受到納米細(xì)菌攻擊以后，細(xì)胞表面豐富的微絨毛減少，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹明顯，嚴(yán)重情況下細(xì)菌侵入細(xì)胞內(nèi)部，造成細(xì)胞破裂壞死。
結(jié)論：適宜的方法和條件能有效進(jìn)行膽囊上皮細(xì)胞的體外原代培養(yǎng)；納米細(xì)菌可以在短時(shí)間內(nèi)迅速進(jìn)入膽囊上皮細(xì)胞并對其產(chǎn)生損傷作用，產(chǎn)生從大體形態(tài)到超微結(jié)構(gòu)的一系列改變；且細(xì)菌濃度越高，作用時(shí)間越長，造成的損傷越嚴(yán)重；較短時(shí)間內(nèi)(48小時(shí)內(nèi))被攻擊的膽囊上皮細(xì)胞大部分的死亡方式是壞死而不是凋亡。
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