小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞的應(yīng)用及培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-01-10 09:39:52
一、背景
小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞由野生型細(xì)胞株L中分離得到。對(duì)HAT選擇培養(yǎng)基敏感，并缺失了腺苷轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶與次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶對(duì)8-氮鳥嘌呤(0.003mg/ml)和6-硫代鳥嘌呤(0.1mM)有抗性。
1、小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1)準(zhǔn)備：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3)凍存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
2、小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞處理：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4、將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
1、細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入2ml完全培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2、1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。明舟生物（mingzhoubio）按每個(gè)凍存管細(xì)胞數(shù)目大于1X106個(gè)細(xì)胞凍存。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，至少2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
實(shí)驗(yàn)擬明確自體骨移植物成骨能力的來源以及自體骨移植物離體后保存的時(shí)間、溫度以及溶液對(duì)其成骨能力的影響,進(jìn)而探究通過調(diào)整自體骨移植術(shù)中各項(xiàng)影響因素、改善自體骨移植物成骨能力的可行性。本實(shí)驗(yàn)有助于開發(fā)一種臨床治療方法,改善患者的自體骨移植功效,加速骨修復(fù)。
方法：
1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Lewis大鼠購自Charles River并用于脊柱融合實(shí)驗(yàn)。所有其他實(shí)驗(yàn)使用小鼠。為了模擬自體骨移植,將同基因鼠用于骨移植。野生型、β-actin-GFP和Axin2LacZ/+小鼠來自Jackson Labs,Axin2CreERT2/+;R26Rm TmG/+小鼠由來自Jackson Labs的Axin2CreERT2/+和R26RmTm G/+小鼠產(chǎn)生。小鼠骨骼成熟為8-16周齡,老年小鼠為>12月齡。
2、手術(shù)方法:SRC骨移植,脛骨單皮質(zhì)缺損骨移植,顱頂骨移植,上頜無牙嵴缺損骨移植,OVX手術(shù)。
3、檢測(cè)方法:組織學(xué):苯胺藍(lán),ALP、TRAP活性和五色染色法;免疫組織化學(xué)染色;細(xì)胞活性檢測(cè):TUNEL染色、臺(tái)盼藍(lán)染色、Caspase3活性;qRT-PCR;內(nèi)吞作用測(cè)定;Wnt活性的測(cè)定。
4、統(tǒng)計(jì)方法:結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)和單因素方差分析兩種方法用于確定數(shù)據(jù)之間的顯著差異。P值<0.05認(rèn)為是差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果：
1、自體骨移植物移植后,存活的細(xì)胞富集在礦化基質(zhì)周圍。與骨髓細(xì)胞部分相比,骨移植物的礦化基質(zhì)部分表現(xiàn)出明顯的增殖能力和成骨活性。
2、盡管在礦化基質(zhì)部分和DBM中的骨碎片都是失活的,并且被密集的細(xì)胞群包圍,但DBM中的Runx2陽性細(xì)胞很少,且ALP活性最低,與自體骨移植物相比,其成骨能力較差。
3、Wnt應(yīng)答細(xì)胞主要存在于骨移植物的礦化基質(zhì)表面,為骨祖細(xì)胞。在修復(fù)時(shí),這些細(xì)胞參與成骨分化的過程,直接促進(jìn)骨再生,其數(shù)量受自體骨移植物的供體年齡影響。
4、隨著離體時(shí)間的增加,凋亡細(xì)胞的數(shù)量持續(xù)增加,細(xì)胞活力下降,而從相同動(dòng)物獲取的相同體積的骨移植物生成的新骨骨量也減少。隨著離體時(shí)間的增加,Wnt應(yīng)答細(xì)胞群逐漸凋亡。
5、當(dāng)骨移植物在4℃離體即刻時(shí),細(xì)胞壞死處于最低水平。當(dāng)骨移植物在37℃下離體1小時(shí)時(shí),細(xì)胞壞死最多。盡管細(xì)胞壞死程度存在差異,但在37℃保存1小時(shí)的骨移植物產(chǎn)生的新骨量與在23℃保存的骨移植物相同。然而,如果將骨移植物保存在4℃,則比在23℃下保存的骨移植物形成的新骨的量增多。與保存在4℃下的骨移植物相比,保存在23℃和37℃下的骨移植物具有較少的Wnt應(yīng)答細(xì)胞,骨移植物的成骨能力也降低。
6、在4℃生理鹽水中保存自體骨移植物可以保持細(xì)胞活力,相反,將自體骨移植物保存在37oC生理鹽水中會(huì)降低細(xì)胞活力。無論保存溫度如何,在含10%FBS的DMEM溶液中孵育的骨移植物的成骨能力均強(qiáng)于生理鹽水中保存的骨移植物。
結(jié)論：
1、自體骨移植物中附著于礦化基質(zhì)的Wnt應(yīng)答細(xì)胞為骨祖細(xì)胞,是自體骨移植物成骨能力的來源。
2、在生理溫度下,小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞可以極大程度地增強(qiáng)自體骨移植物的細(xì)胞活性、增殖能力和成骨潛能,提高自體骨移植物的成骨能力。
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