HFF-1細胞的特性與復蘇及傳代與凍存操作說明！
小楊 / 2024-01-10 09:01:19
一、背景
HFF-1是從新生兒包皮中分離建立，可用作飼養(yǎng)層細胞，用于支持胚胎干細胞的生長或維持胚胎干細胞的未分化狀態(tài)。
1、細胞純度高于90%；
2、細胞生長特性：貼壁生長；
3、細胞形態(tài)：成纖維細胞樣，長梭形，邊緣不規(guī)則，單層貼壁生長，背景干凈；
4、分離基物：取白人新生男孩的包皮制備獲得；
5、不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
三、細胞培養(yǎng)操作步驟
1、凍存管從液氮或-80℃冰箱中取出放入PE手套中，迅速沒入37℃水浴鍋，搖晃凍存管加速溶解，以1min內(nèi)全部溶解為宜；
2、在超凈臺中將溶解好的細胞液加入到裝有9mL完全培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1000-1200rpm離心5min，棄去上清液，用1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞；
3、將細胞懸液加入到含有5-6mL完全培養(yǎng)基的T25瓶中，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
1、將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入1-2mL胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA）；
2、鏡下觀察消化情況，在細胞邊緣縮小，貼壁松動時（可用吸管吸起些許胰酶輕輕吹打細胞層某處，肉眼可見細胞層脫落，即消化完成，否則繼續(xù)消化），直接吸掉胰酶，加入5-6mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打細胞層，把細胞層吹落，吹散；
3、將細胞懸液按1:2比例分到新的T25瓶中，添加適當?shù)耐耆囵B(yǎng)基，把細胞懸液打勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
4、注意培養(yǎng)基pH值變化和細胞密度，定期換液（每周2-3次），待細胞密度達到80%-90%時，重復傳代操作或者凍存。
收到細胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例：
1、細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
四、應用
HFF-1可以用于胎兒皮膚來源干細胞的鑒定及其細胞功能的相關研究：
胎兒組織來源的干細胞,可能具有更低的免疫原性和更強的增殖與分化能力,更有希望降低細胞的異體移植引起的免疫排斥風險而更適用于異體移植,同時在短期內(nèi)可為細胞治療提供充足的細胞來源,因而具有獨特的優(yōu)勢與研究潛能。
實驗提取人胎兒皮膚的干細胞,并將其命名為胎兒皮膚來源干細胞(Fetal Dermal-derived Stem Cells;FDSCs),在裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面中初步探究該細胞是否具有促進創(chuàng)面愈合的作用,并對該細胞進行鑒定和增殖與遷移力檢測。從而為應用FDSCs治療創(chuàng)面或?qū)⑵渥鰹榻M織工程皮膚的種子細胞提供實驗研究證據(jù)。
目的：
1、通過裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面模型研究FDSCs是否具有促進創(chuàng)面愈合的作用;
2、通過細胞形態(tài)學、表面標志物的檢測和誘導分化實驗,對FDSCs進行鑒定,分析其是否是一種間充質(zhì)干細胞。
3、通過與創(chuàng)面治療研究最多的脂肪間充質(zhì)干細胞(ADSCs)和人皮膚成纖維細胞(HFF-1)進行增殖與遷移力的對比分析,研究FDSCs是否具有更好的創(chuàng)面修復功能。
方法：
1、在裸鼠背部作1.2cm全層皮膚缺損創(chuàng)面模型,實驗組在缺損創(chuàng)緣沿皮下注射不同劑量FDSCs,對照組注射細胞培養(yǎng)基以及不做任何處理的空白對照,分別在0、3、7、10、14天時觀察拍照,比較不同組創(chuàng)面愈合率,并取皮膚標本作病理檢測分析。
2、對三種細胞進行傳代培養(yǎng)并觀察細胞形態(tài)、采用流式細胞術檢測三種細胞間充質(zhì)干細胞(MSCs)相關表面標志物表達情況,進一步對三種細胞進行成脂、成骨分化誘導,從而鑒定FDSCs是否是一種間充質(zhì)干細胞。
3、采用CFSE染色法對FDSCs、ADSCs、HFF-1三種細胞同時進行染色,培養(yǎng)一段時間后通過熒光表達量計算三種細胞的相對增殖率;使用六孔培養(yǎng)板同時培養(yǎng)三種細胞,同時對三種細胞進行劃痕實驗比較三種細胞的遷移率。
結(jié)果：
1、與對照組相比,FDSCs注射組裸鼠創(chuàng)面在3、7、10、14天均表現(xiàn)出更高的創(chuàng)面愈合率,且中(5x106)、高(1x107)劑量細胞注射組創(chuàng)面愈合率增高明顯,結(jié)果具統(tǒng)計學意義。病理檢測結(jié)果顯示,FDSCs注射組表皮增厚,皮膚再上皮化增強。
2、FDSCs、ADSCs、HFF-1的細胞形態(tài)無明顯差異,均呈長梭形、呈典型的成纖維細胞樣形態(tài)。細胞表面標志物檢測顯示:三種細胞均表達MSCs相關表面標志物,即CD44、CD73、CD90、CD105呈陽性表達,表達百分比在90%以上;造血細胞相關標志物CD14、CD45、CD34均呈陰性表達;與異體移植免疫排斥相關的表面分子HLA-DR三種細胞均呈陰性表達,但表達百分比FDSCs低于ADSCs和HFF-1。進一步誘導誘導分化實驗結(jié)果顯示,FDSCs、ADSCs均能向脂肪細胞、骨細胞分化,而HFF-1無明顯分化跡象。
3、對三種細胞的增殖率和遷移率檢測結(jié)果均表現(xiàn)出:FDSCs最快、HFF-1次之、ADSCs最慢。
結(jié)論：
1、胎兒皮膚來源干細胞能加速裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合,且中、高劑量組促愈合作用較明顯。
2、胎兒皮膚來源干細胞可能是一種胎兒皮膚間充質(zhì)干細胞。
3、胎兒皮膚來源干細胞較HFF-1及ADSCs增殖與遷移更快,可能具有更好的創(chuàng)面修復功能。
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