小鼠小膠質瘤細胞的培養(yǎng)操作步驟及應用研究！
小楊 / 2024-01-11 09:57:45
一、背景
小鼠小膠質瘤細胞是由E·Blasi建立于1990年；此細胞源自C57BL/6小鼠小膠質細胞。由小鼠小神經膠質細胞經逆轉錄病毒介導轉染v-raf/v-myc獲永生化。BV-2細胞保留有小神經膠質細胞多種形態(tài)、表征和功能特征；免疫組化結果顯示，BV-2細胞為MAC1、MAC2陽性；而MAC3、膠質細胞原纖維酸性蛋白、半乳糖腦苷脂為陰性。膜表面表達envgp70抗原；在形態(tài)學、表型及功能上有吞噬細胞的特征。
1、小鼠膠質細胞瘤培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：
1）準備DMEM培養(yǎng)基；優(yōu)質胎牛血清，10%；2mM L-谷氨酰胺;10mM HEPES;雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
2、細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或將細胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：次傳代推薦傳代比例為1:2，以后傳代比例可根據客戶需要自己決定。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
三、應用
應用小鼠腦膠質瘤GL261細胞及人神經膠質瘤U251細胞通過體外實驗探究楊梅黃酮對膠質瘤細胞的抑制作用。主要從以下三個方面進行研究,分別是楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞增殖及凋亡的影響;楊梅黃酮對膠質瘤細胞遷移及侵襲能力的影響;楊梅黃酮對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)體外成管能力的影響。為進一步研究楊梅黃酮對膠質瘤的治療作用及機制奠定實驗基礎。
（一）楊梅黃酮對膠質瘤細胞增殖及凋亡的影響
1、楊梅黃酮對膠質瘤細胞活性的影響通過CCK-8實驗檢測楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞活性的影響。結果顯示,對于GL261細胞,楊梅黃酮在濃度為20μM時即可對其活性產生抑制作用,與對照組相比有統(tǒng)計學差異(p<0.01),隨濃度升高,抑制作用更明顯,并且作用48h表現出比作用24h更強的抑制作用。對于U251細胞,在楊梅黃酮濃度為240μM時對其活性產生抑制作用(p<0.05),隨濃度增加,抑制作用更明顯,并且作用時間延長(48h)也可增強其對U251細胞活性的抑制作用。說明楊梅黃酮對膠質瘤細胞的活性抑制作用具有劑量-時間依賴性。
2、楊梅黃酮對膠質瘤細胞增殖的影響通過流式細胞術檢測楊梅黃酮對兩種細胞周期的影響。結果顯示,楊梅黃酮可增加兩種細胞G1期的比例,將細胞周期阻滯于G1期,從而抑制細胞的增殖。進一步通過Western-blot實驗檢測細胞周期蛋白,結果顯示楊梅黃酮可抑制U251細胞周期蛋白Cycline D1的表達。
3、楊梅黃酮對膠質瘤細胞的凋亡誘導作用通過Hoechst 33342染色觀察楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞的凋亡誘導作用。熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現楊梅黃酮可使兩種膠質瘤細胞凋亡小體出現的比例增加。進一步通過流式細胞術檢測楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞凋亡的影響,結果顯示,楊梅黃酮可增加兩種細胞早期凋亡與晚期凋亡細胞的比例,與相應的對照組相比均有統(tǒng)計學差異(p<0.05),說明楊梅黃酮可誘導膠質瘤細胞的凋亡。
（二）楊梅黃酮對膠質瘤細胞遷移及侵襲的影響
1、楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞遷移的影響利用Transwell實驗檢測楊梅黃酮對GL261與U251細胞遷移的影響。結果顯示,對于GL261細胞,楊梅黃酮濃度在5μM時即表現出對其遷移的抑制作用(p<0.05)。并且隨濃度增加,抑制作用更明顯。對于U251細胞,在楊梅黃酮濃度為100μM及200μM時,均表現出與平行對照有統(tǒng)計學差異(p<0.001)的對U251細胞遷移的抑制作用。
2、楊梅黃酮對GL261細胞與U251細胞侵襲的影響為研究楊梅黃酮對膠質瘤細胞侵襲的影響,我們在Transwell小室底部鋪上Matrigel以模仿細胞外基質,然后進行實驗。
結果顯示,楊梅黃酮可減少穿過小室的GL261細胞與U251細胞的數目,與相應的對照相比,細胞數目差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。通過逆轉錄PCR檢測楊梅黃酮對膠質瘤細胞MMPs m RNA轉錄水平的影響,結果顯示楊梅黃酮可降低GL261細胞內MMP-2、MMP-9的m RNA水平,也可降低U251細胞內MMP-2、MMP-9以及MMP-14的m RNA水平,與相應的對照組相比有統(tǒng)計學差異(p<0.05)。
（三）楊梅黃酮對HUVEC體外成管能力的影響利用CCK-8試劑盒檢測楊梅黃酮對HUVEC增殖的影響,通過HUVEC的遷移及在Matrigel上成管檢測楊梅黃酮對HUVEC成管能力的影響。
結果顯示,楊梅黃酮可抑制HUVEC的增殖,且具有劑量-時間依賴性。劃痕實驗顯示,同對照組相比,楊梅黃酮可抑制HUVEC的遷移(p<0.001)。在成管實驗中,與對照組相比,楊梅黃酮可明顯減少誘導形成的小管的長度(p<0.05)。
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