DMS114人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的應(yīng)用與培養(yǎng)操作步驟！
小楊 / 2024-02-17 09:06:59
一、背景
DMS114人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞是一種人小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞系，由美國國家癌癥研究所(NCI)的模式識(shí)別和分類系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室(PMCL)開發(fā)。該細(xì)胞系最初是從一名患有廣泛分布的小細(xì)胞肺癌的患者身上分離出來的。DMS114細(xì)胞可以表達(dá)EGF和CR3補(bǔ)體，表達(dá)HLA I類和II類抗原。DMS114細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和癌癥研究。
DMS114細(xì)胞系具有高度增殖能力和快速生長速度的特點(diǎn)，因此在腫瘤研究中被廣泛使用。此外，該細(xì)胞系還表現(xiàn)出對多種化學(xué)治療藥物的敏感性，包括順鉑、依托泊苷、長春新堿等。
由于DMS114細(xì)胞系的特殊性質(zhì)，它被廣泛應(yīng)用于臨床前的藥物篩選和臨床試驗(yàn)中。例如，一些針對小細(xì)胞肺癌的新藥已經(jīng)在該細(xì)胞系上進(jìn)行了測試，以評估其療效和安全性。
（一）DMS114人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞復(fù)蘇
①新制100mm平皿1個(gè)，含12mL上述培養(yǎng)液；
②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水浴1~2min,待完全溶解后盡快移入安全柜復(fù)蘇；
③用無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時(shí)針搖勻；
④放入（37℃，5%CO2）培養(yǎng)箱中，過夜換液，2-4天長滿。
注意：建議復(fù)蘇凍存細(xì)胞時(shí)始終使用防護(hù)手套、衣服和戴上防護(hù)面罩，避免凍存管處于溫差較大情況下發(fā)生爆炸造成人員傷害。
（二）DMS114人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞傳代
將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入2mL（/100mm皿/T25瓶）胰酶（0.25%Trypsin+0.02%EDTA），在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細(xì)胞剛有脫落時(shí)，吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約1min取出。傳代用6mL培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細(xì)胞，后可1:2傳代。
（三）DMS114人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凍存
凍存則用3mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為3支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存。
三、應(yīng)用
研究FGFR1的激活是否以及怎樣促進(jìn)FGFR1擴(kuò)增型肺癌的EMT和轉(zhuǎn)移,闡明FGFR1促進(jìn)FGFR1擴(kuò)增型肺癌EMT和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,并探究該機(jī)制在肺癌FGFR1靶向治療中的臨床意義。
方法：首先,我們分別采用FGFR1的配體成纖維細(xì)胞生長因子2(Fibroblast growth factor2,FGF2)和短干擾RNAs(Short interfering RNAs,siRNAs)在FGFR1擴(kuò)增型肺癌細(xì)胞系中激活和抑制FGFR1,運(yùn)用CCK8、Western blot、qPCR、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移侵襲實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色等方法,鑒定細(xì)胞增殖、EMT、遷移侵襲等能力是否變化,并探究此過程的分子信號通路。
其次,我們運(yùn)用MEK/ERK抑制劑AZD6244和持續(xù)自主磷酸化突變體ERK2R67S質(zhì)粒和慢病毒,體內(nèi)體外研究FGFR1激活后是否通過下游ERK1/2的磷酸化調(diào)控Y染色體性別決定區(qū)相關(guān)HMG盒蛋白2(Sry(Sex determining region of Y chromosome)-related HMG box 2,SOX2)的表達(dá)。再次,我們運(yùn)用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建SOX2過表達(dá)和沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,研究FGFR1是否通過SOX2促進(jìn)增殖、EMT和轉(zhuǎn)移。
進(jìn)一步,運(yùn)用FGFR1擴(kuò)增型肺癌細(xì)胞系、及SOX2過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)FGFR1擴(kuò)增型細(xì)胞株和免疫缺陷小鼠構(gòu)建皮下和原位肺癌移植瘤模型,給予FGFR1抑制劑AZD4547,觀察體內(nèi)抑制FGFR1信號通路對腫瘤生長、SOX2表達(dá)、EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移的影響,以及體內(nèi)驗(yàn)證SOX2在FGFR1擴(kuò)增型肺癌的增殖、EMT、轉(zhuǎn)移中的重要作用。最后,我們分析了肺癌患者數(shù)據(jù)庫中FGFR1和SOX2過表達(dá)對臨床預(yù)后的影響。
結(jié)果：FGFR1的激活促進(jìn)FGFR1擴(kuò)增型肺癌細(xì)胞系H1581和DMS114的增殖、EMT和遷移侵襲,而抑制FGFR1可抑制這些過程。FGFR1激活后通過下游ERK1/2的磷酸化上調(diào)SOX2的表達(dá),并且持續(xù)自主磷酸化突變體ERK2R67S質(zhì)粒上調(diào)SOX2的作用不被FGFR1抑制劑AZD4547或MEK/ERK抑制劑AZD6244抑制。ERK2R67S慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株在體內(nèi)同樣促進(jìn)SOX2表達(dá)。過表達(dá)SOX2體內(nèi)體外均可促進(jìn)細(xì)胞增殖、EMT、遷移侵襲和轉(zhuǎn)移,并且不被FGFR1抑制劑AZD4547抑制;相反,SOX2沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中激活FGFR1不能促進(jìn)這些過程。重要的是,在SOX2沉默的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中,激活FGFR1不能促進(jìn)這些過程。在皮下和原位肺癌移植瘤模型中,抑制FGFR1抑制腫瘤生長、SOX2表達(dá)、EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移。肺癌患者中,高表達(dá)FGFR1與高表達(dá)SOX2正相關(guān),并均與生存期短相關(guān)。
結(jié)論：研究新發(fā)現(xiàn)了FGFR1的激活通過下游ERK1/2的磷酸化上調(diào)SOX2的表達(dá),并在體外和體內(nèi)證實(shí)FGFR1-ERK1/2-SOX2軸促進(jìn)FGFR1擴(kuò)增型肺癌的增殖、EMT和轉(zhuǎn)移。該研究對FGFR1靶向治療具有重要臨床意義。
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