NCI-H1688人典型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-03-09 08:53:09
一、背景
NCI-H1688人典型小細(xì)胞肺癌細(xì)胞是一種人經(jīng)典小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，來源于一位小細(xì)胞肺癌患者的胸腔積液。這種細(xì)胞系具有上皮細(xì)胞樣的形態(tài)，并且貼壁生長。NCI-H1688細(xì)胞系被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究，特別是小細(xì)胞肺癌的研究。
首先，NCI-H1688細(xì)胞系可用于模擬小細(xì)胞肺癌在體內(nèi)的生物學(xué)行為。通過體外培養(yǎng)這些細(xì)胞，研究人員可以觀察它們的生長特性、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等過程，從而深入了解小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機(jī)制。
其次，NCI-H1688細(xì)胞系還可用于藥物篩選和治療方法的研究。研究人員可以使用這些細(xì)胞來測試新藥物對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性、抗增殖作用或誘導(dǎo)凋亡的能力，從而為臨床治療提供藥物選擇和劑。
1)復(fù)蘇NCI-H1688細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)NCI-H1688細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)NCI-H1688細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
MicroRNA-150對人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系生物學(xué)表型的影響背景和目的：通過檢測小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)microRNA-150表達(dá)水平可直接影響總體生存時間和無進(jìn)展生存時間,是SCLC患者預(yù)后的獨立因素。本實驗旨在研究miR-150高表達(dá)在體外對于肺癌細(xì)胞系的表型的影響。
材料與方法：采用化學(xué)方法合成成熟的miR-150寡核苷酸模擬物,以lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI-H446和NCI-H1688。轉(zhuǎn)染后48小時,采用real-time RT-PCR技術(shù)測定miR-150在各細(xì)胞系中的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染后24小時,通過MTS法繪制各細(xì)胞系的增殖曲線；采用transwell模型及預(yù)鋪matrigel的transwell模型分別進(jìn)行遷移、侵襲實驗；采用PI(propidium iodide)染色法,流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期分布。轉(zhuǎn)染后24小時,以順鉑處理細(xì)胞24小時,之后采用Annexin-FITC/PI雙染色,流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞凋亡。構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)miR-150的H446、H1688細(xì)胞系,按照相同方法檢測增殖能力、遷移能力、侵襲能力、細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡。
研究結(jié)果：轉(zhuǎn)染后48小時,NCI-H446和NCI-H1688細(xì)胞中miR-150的表達(dá)水平均顯著上調(diào)。NCI-H446、NCI-H1688穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞較對照miR-150表達(dá)水平顯著上調(diào)。在體外遷移實驗中,miR-150高表達(dá)的NCI-H446細(xì)胞系和對照組穿過膜細(xì)胞數(shù)分別為104±3、170±4,miR-150高表達(dá)的NCI-H1688細(xì)胞系和對照組穿過膜細(xì)胞數(shù)分別為71±2、120±3,差異有統(tǒng)計學(xué)意義：侵襲試驗中,miR-150高表達(dá)的NCI-H446細(xì)胞系和對照組穿過膜細(xì)胞數(shù)分別為44±3、84±2,miR-150高表達(dá)的NCI-H1688細(xì)胞系和對照組穿過膜細(xì)胞數(shù)分別為35±2、60±3,差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而miR-150高表達(dá)對NCI-H446和NCI-H1688細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期分布以及順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均無顯著影響。結(jié)論：miR-150可能通過抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力而在小細(xì)胞肺癌患者中發(fā)揮保護(hù)性作用。
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