TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系的應(yīng)用與培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-03-09 09:08:36
一、背景
TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系是一種來(lái)源于小鼠腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞系，常用于研究腎臟疾病的發(fā)生機(jī)制、藥物篩選和毒性評(píng)價(jià)等。該細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)：
來(lái)源：TCMK-1細(xì)胞系來(lái)源于小鼠腎小管上皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多次傳代和篩選，形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系。
形態(tài)特征：TCMK-1細(xì)胞呈多邊形或長(zhǎng)條形，大小約為15-30微米，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁明顯。
生長(zhǎng)特性：TCMK-1細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，傳代周期約為24-48小時(shí)，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長(zhǎng)。
特異性標(biāo)志物：TCMK-1細(xì)胞表達(dá)多種特異性標(biāo)志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鑒定其腎小管上皮細(xì)胞特性。
其他特性：TCMK-1細(xì)胞還具有一定的增殖能力，可用作研究腎臟疾病發(fā)生機(jī)制和藥物篩選的模型。
1)復(fù)蘇TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
Tisp40與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系目的：探討Tisp40在缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子betal(Transforming growth factor betal,TGF-β1)誘導(dǎo)的TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系中表達(dá)量的變化,驗(yàn)證所構(gòu)建的慢病毒轉(zhuǎn)染Tisp40過(guò)表達(dá)細(xì)胞系TCMK-1/Tisp40效果并在3種所構(gòu)建的siRNA-Tisp40中篩選沉默效果最好的siRNA-Tisp40。
方法：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)C57BL/6小鼠I/R建立腎臟纖維化動(dòng)物模型,免疫組化、RT-PCR及Western blot檢測(cè)各組小鼠腎臟Tisp40的分布與表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)采用TGF-β1(10ng/ml)刺激TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系24h建立腎細(xì)胞纖維化模型,Western blot檢測(cè)TGF-β1不同濃度(0.1,1,10ng/ml)及刺激時(shí)間(4,8,12,24,48h)下Tisp40蛋白的表達(dá)變化。在野生型TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系(TCMK-1/wildtype,TCMK-1/wt)及Tisp40過(guò)表達(dá)的TCMK-1/Tisp40細(xì)胞中,RT-PCR及Western blot檢測(cè)Tisp40 mRNA及蛋白表達(dá)變化,免疫熒光評(píng)估所構(gòu)建的TCMK-1/Tisp40細(xì)胞效果。Western blot檢測(cè)Tisp40被沉默后的蛋白表達(dá),比較三種siRNA-Tisp40(siRNAl-Tisp40,siRNA2-Tisp40,siRNA3-Tisp40)沉默效率。
結(jié)果：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)假手術(shù)組小鼠(Sham)腎臟Tisp40表達(dá)較少;缺血再灌注纖維化組(I/R)中小鼠腎臟Tisp40mRNA及蛋白表達(dá)明顯增加(p<0.05),Tisp40蛋白主要表達(dá)于腎小管。體外實(shí)驗(yàn)Tisp40隨TGF-β1濃度(0.1,1,10ng/ml)及刺激時(shí)間(4,8,12,24,48h)改變,表達(dá)逐漸增多,存在濃度及時(shí)間依賴性,在lOng/mlTGF-βi刺激24h后Tisp40表達(dá)基本穩(wěn)定;TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系/wt細(xì)胞在TGF-β1刺激前,僅少量表達(dá)Tisp40,TCMK-1/wt細(xì)胞及TCMK-1/Tisp40細(xì)胞經(jīng)TGF-β1刺激24h后,Tisp40mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多(p<0.05),在TGF-β1刺激前后,TCMK-1小鼠腎小管上皮細(xì)胞系/Tisp40細(xì)胞的Tisp40表達(dá)均高于TCMK-1/wt細(xì)胞(p<0.05),Tisp40過(guò)表達(dá)細(xì)胞系TCMK-1/Tisp40構(gòu)建成功。3種siRNA-Tisp40均可沉默Tisp40,siRNA3-Tisp40沉默效率最高。
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