伊氏副球菌的菌株培養(yǎng)與注意事項及保存方法！
小楊 / 2024-03-15 09:09:31
伊氏副球菌是Paracoccus屬的微生物，原產(chǎn)地為中國。菌體球形或近球形，單個、成對或成簇排列，革蘭氏陰性。主要用途為研究，具體用途為發(fā)酵普洱茶。
一、菌種簡介
規(guī)格：凍干物
拉丁屬名：Paracoccus Yeei
拉丁名稱：Paracoccus yeei
來源歷史：←自行分離
收藏時間：2017-12-20
原始編號：G2-13
原產(chǎn)國：中國
資源歸類編碼：15131135102
模式菌株：非模式菌株
主要用途：研究
特征特性：菌體球形或近球形，單個、成對或成簇排列，革蘭氏陰性。
具體用途：發(fā)酵普洱茶。
生物危害程度：四類
培養(yǎng)基編號：CM0847
培養(yǎng)基名稱：胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）(CAIQ0701)
培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨 15.0g，大豆胨 5.0g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 13.0 g，蒸餾水 1.0L，pH7.3±0.2。推薦使用商品化成品培養(yǎng)基。
培養(yǎng)溫度：28℃
需氧類型：好氧
分離基物：曬青毛茶
采集地：云南勐海
保存方法：-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法
共享方式：公益性共享；資源純交易性共享；合作研究共享；資源交換性共享
提供形式：凍干物
用途：發(fā)酵普洱茶
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
二、培養(yǎng)基
MRS 培養(yǎng)基
酪蛋白胨 10 克 牛肉浸取物 10 克
酵母提取液 5.0 克 葡萄糖 20 克
乙酸鈉 5.0 克 檸檬酸二胺 2.0 克
吐溫 80 1.0 克 磷酸氫二鉀 2.0 克
七水硫酸鎂 0.2 克 七水硫酸錳 0.05 克
碳酸鈣 20.0 克 瓊脂 20.0 克
蒸餾水 1.0 升 PH 6.8
如果要配制液體培養(yǎng)基，則不用加入碳酸鈣和瓊脂
三、保藏條件
斜面菌種和凍干菌種應(yīng)在 2-8°C 保存。西林瓶請置于-20°C 保存。甘油請置于-80 度。
四、培養(yǎng)方法
1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。
2、挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進一步擴大菌體量及合成產(chǎn)物之用。
3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。
4、保存在沙土管或冷凍管中的菌種，用無菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫度）下培養(yǎng)5～7天（或較長時間。所得孢子還需進一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子（對于霉菌類孢子制備，多數(shù)采用大米、小米之類的天然培養(yǎng)基）。
5、將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在上延續(xù)使用半年左右。
6、如果有些菌種不產(chǎn)孢子，如赤霉素產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的，則可采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿），及無機鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐的種子應(yīng)生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。
五、注意事項
1) 首次活化，用盡量少的復(fù)水液溶解，接種在 5ml 的液體培養(yǎng)基中，靜止培養(yǎng)，如有不明白之處，請務(wù)必先咨詢我單位技術(shù)人員，避免不必要的損失；二次接種量要多，固體斜面培養(yǎng)基水分要少才能讓菌體長得比較明顯，液體培養(yǎng)要靜止培養(yǎng)；
2) 經(jīng)過冷凍干燥保藏，菌種處于休眠狀態(tài)，復(fù)蘇培養(yǎng)時可能會延遲生長，這時需較長的培養(yǎng)時間； 若您收到的是已復(fù)蘇的培養(yǎng)物（非凍干菌），則可以直接用于您的實驗，或根據(jù)需要轉(zhuǎn)接培養(yǎng)如有不明白之處，請務(wù)必先咨詢我單位技術(shù)人員，避免不必要的損失；
3）微生物菌種應(yīng)保藏于低溫、清潔干燥的地方，室溫放置時間過長會導(dǎo)致菌種衰退；
4）菌種操作應(yīng)在無菌條件下進行；轉(zhuǎn)種完畢，應(yīng)經(jīng)滅菌再做丟棄處理；
5）應(yīng)根據(jù)菌種狀況及時轉(zhuǎn)接，凍干菌種保藏時間通常為 2-25 年；
6）菌種使用過程中如出現(xiàn)雜菌污染或菌種生產(chǎn)性能下降，應(yīng)及時和
微生物菌種查詢網(wǎng)聯(lián)系；
7）如若有菌種復(fù)蘇不活或者污染等情況，請在收到菌種后 2 個月內(nèi)聯(lián)系，逾期不予受理；
8）打管操作需由專業(yè)微生物技術(shù)人員在相應(yīng)的防護設(shè)備中進行，生物危害程度為三類的菌種應(yīng)在生物安全柜中操作，打管時凍干管應(yīng)遠離面部，保護眼睛；
9）安瓿瓶開封：用浸過 75％酒精的脫脂棉擦凈安瓿管，用火焰加熱其頂端，滴少量（2-3滴）無菌水至加熱頂端使之破裂，用銼刀或者鑷子敲下已破裂的安瓿管頂端并將凍干管開口處在火焰上過一遍，并保持在火焰旁操作；
10）甘油管使用：使用本甘油菌時可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或進行液體培養(yǎng)即可。也可以完全融解后使用，但隨著凍融次數(shù)的增加，細菌的活力會逐漸下降。
六、保存方法
1、傳代保存法：培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。
3、懸液保存法：
①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。
②糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
4、載體保存法：①土壤保存法；②砂土保存法；③硅膠保存法；④磁珠保存法；⑤麩皮保存法；⑥紙片(濾紙)保存法。
5、常用的冷凍保存法：
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多，有些可添加保護劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右)：即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進行冷凍保存。
③液氮保存法(-196℃)：是適用范圍*的微生物保存法。
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