大鼠支氣管上皮細(xì)胞的知識(shí)與應(yīng)用及其培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-03-16 09:45:41
一、背景
大鼠支氣管上皮細(xì)胞是構(gòu)成大鼠呼吸道的重要組成部分，主要位于支氣管內(nèi)壁。這些細(xì)胞在維持呼吸道功能、防止病原體入侵以及參與氣道免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。
在生物醫(yī)學(xué)研究中，
大鼠支氣管上皮細(xì)胞被廣泛用于模擬和研究人類(lèi)支氣管上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性、功能以及疾病發(fā)生機(jī)制。這些細(xì)胞可以用于研究呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）等呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法。
為了獲取
大鼠支氣管上皮細(xì)胞，研究人員通常需要通過(guò)特定的方法從大鼠的支氣管組織中分離和培養(yǎng)這些細(xì)胞。培養(yǎng)過(guò)程需要特定的培養(yǎng)基和條件，以確保細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性。
在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，
大鼠支氣管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作需要遵守嚴(yán)格的無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)范，以確保細(xì)胞的純度和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
1)復(fù)蘇大鼠支氣管上皮細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)大鼠支氣管上皮細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)大鼠支氣管上皮細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
大鼠支氣管上皮細(xì)胞可以用于PERK/eIF2α通路負(fù)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抵抗COPD氣道上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究：
體外研究發(fā)現(xiàn)在PERK/eIF2a這條通路被敲除后,細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致凋亡敏感性增加,而增強(qiáng)PERK/eIF2a通路,細(xì)胞凋亡減少,證明上調(diào)PERK通路在ERS中具有對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用。基于目前在COPD發(fā)病中,PERK/eIF2a通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中如何作用,其與CHOP、caspase關(guān)系尚不明確,擬以COPD大鼠及香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)大鼠支氣管上皮細(xì)胞(HBE)為主要模型,探討PERK通路相關(guān)信號(hào)分子、凋亡信號(hào)指標(biāo)及之間關(guān)系,研究PERK通路的活化劑salubrinal在其中的作用,旨在證實(shí)PERK通路在COPD內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中具有重要作用,為臨床治療COPD提供新的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。
PERK/eIF2a通路在COPD大鼠支氣管上皮細(xì)胞大鼠支氣管肺組織中凋亡中的作用目的：觀察PERK通路在COPD大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致支氣管肺組織是否活化及salubrinal對(duì)香煙煙霧所致氣道上皮細(xì)胞凋亡的影響。
方法：36只Wistar大鼠隨機(jī)均分為3組：正常對(duì)照組、COPD模型組、COPD模型加藥物組(簡(jiǎn)稱(chēng)干預(yù)組)。采用被動(dòng)吸煙加氣管內(nèi)滴注脂多糖(LPS)法建立大鼠COPD模型,藥物組在滴注脂多糖的同時(shí)氣管內(nèi)滴注salubrinal(1mg/kg)。造模完成后,測(cè)定各組大鼠的肺功能；觀察肺組織病理學(xué)變化；大鼠支氣管上皮細(xì)胞免疫組化檢測(cè)p-PERK、p-eIF2a、caspase-12在支氣管肺組織中的表達(dá)和分布；western blot檢測(cè)p-PERK、p-eIF2α、active caspase-12和active caspase-3蛋白水平；TUNEL法檢測(cè)支氣管肺組織上皮細(xì)胞凋亡。
結(jié)果：模型組的各項(xiàng)肺功能指標(biāo)較正常組均明顯降低,但以salubrinal干預(yù)后大鼠各項(xiàng)肺功能指標(biāo)較于模型組有明顯升高。在模型組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路的指標(biāo)p-PERK、p-eIF2a較正常組相比增高,而干預(yù)組的p-eIF2a的表達(dá)水平最高；模型組的大鼠支氣管上皮細(xì)胞凋亡指標(biāo)active caspase-12和active caspase-3表達(dá)較正常組明顯升高,干預(yù)組凋亡較模型組減少。
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