日本四聯(lián)球狀菌的培養(yǎng)與保存方法及操作流程！
小楊 / 2024-03-19 09:11:51
日本四聯(lián)球狀菌是Tetrasphaera屬的微生物，原產(chǎn)地為日本。放線菌門微球菌目細菌。主要用途為分類學研究，具體用途為模式菌株。
一、菌種簡介
提供形式：凍干物
拉丁屬名：Tetrasphaera Japonica
拉丁學名：Tetrasphaera japonica
原始編號：NBRC 103088
菌株來源：←NBRC
保藏人：周宇光
直接來源國家：日本
保藏時間：10/26/2010
其他保藏編號：=DSM 13192 =JCM 21381
生物危害：四類
模式菌株：模式菌株
菌株用途：模式菌株
培養(yǎng)溫度：30℃
培養(yǎng)基：0238
分離源：活性污泥
采集國家：日本
用途：模式菌株
注意事項：僅用于科學研究或者工業(yè)應用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準）
二、培養(yǎng)方法
1、平板劃線分離法:把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細胞用接種環(huán)圈在平板培養(yǎng)基表面,通過分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨立分布的單個細胞,經(jīng)培養(yǎng)后生長繁殖成單菌落。
2、稀釋涂布平板法將菌液進行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng),在稀釋度足夠高的菌液里,聚集在一起的微生物將被分散成單個細胞,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個菌落。
上述兩種方法雖然都可以實現(xiàn)觀察菌落特征的目的,但平板劃線分離法不能對菌落計數(shù),而稀釋涂布平板法培養(yǎng)過程復雜,對平板的要求比較高,可參照以下步驟:
a、制備平板培養(yǎng)基將氯化鈉蔗糖瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化并冷卻至65℃,向氯化鈉蔗糖瓊脂培養(yǎng)基中加入克林霉素溶液3~5ml并混合均勻,然后取20ml混合均勻的培養(yǎng)基溶液倒入培養(yǎng)皿,輕輕搖動培養(yǎng)皿,使培養(yǎng)基溶液均勻分布在培養(yǎng)皿底部,待培養(yǎng)基溶液凝固后即得平板培養(yǎng)基。
b、制備活性污泥混合液稱取活性污泥土樣15g,放入盛100ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,振搖15~20min混合均勻,用一支1ml無菌吸管從中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無菌水的大試管中充分混勻,制成活性污泥混合液。
c、培養(yǎng)基涂布從活性污泥混合液中吸取0.2ml,滴在平板培養(yǎng)基表面的中央位置,用無菌玻璃涂棒將活性污泥混合液沿同心圓方向輕輕地向外擴展,使之分布均勻。
三、操作流程
菌株復蘇:(按三區(qū)劃線法將留菌管內(nèi)的原始菌株進行復蘇)
1) 所有菌株,顯色培養(yǎng)基分4區(qū),每區(qū)一株,標明菌株號、菌種名常用縮寫如下:
cal: 白念珠菌 cgl:光滑念珠菌 cpa: 近平滑念珠菌 ctr: 熱帶念珠菌 ckr: 克柔念珠菌 cne: 新型隱球菌,其他菌種標記全名
2) 隱球菌除傳顯色培養(yǎng)基以外,另傳1/2塊血平皿上述菌株統(tǒng)一37oC孵育48h
菌種鑒定:(48h后觀察結果)
四、保存方法
1、傳代保存法：培養(yǎng)基的濃度不宜過高,營養(yǎng)成分不宜過于豐富,尤其是碳水化合物的濃度應在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種,則應在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
2、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時間更長,適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細菌等的保存。
3、懸液保存法：
①蒸餾水保存法:適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應注意避免水分的蒸發(fā)。
②糖液保存法:適用于酵母菌,如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,然后于冷暗處保存,可長達10年。除此之外,也可使用緩沖液或食鹽水等進行保存。
4、載體保存法：①土壤保存法;②砂土保存法;③硅膠保存法;④磁珠保存法;⑤麩皮保存法;⑥紙片(濾紙)保存法。
5、常用的冷凍保存法：
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃):低溫冷凍保存時使用螺旋口試管較為方便,也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時菌液加量不宜過多,有些可添加保護劑。此外,也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi),再放入低溫冰箱內(nèi)進行保存的。
②干冰保存法(-70℃左右):即將菌種管插入干冰內(nèi),再置于冰箱內(nèi)進行冷凍保存。
③液氮保存法(-196℃):是適用范圍最廣的微生物保存法。
五、注意事項
1、菌種常規(guī)培養(yǎng)時間：細菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。
2、菌種恢復培養(yǎng)前，建議將收到的菌種安瓿保存在 6-10°C 的環(huán)境下，某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后處于休眠狀態(tài)，延遲期較長，如在說明建議的培養(yǎng)時間還未長起來，請繼續(xù)在相應的環(huán)境下多培養(yǎng) 24 小時或者更長時間，直至菌種培養(yǎng)完成，有的菌種需要連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長，一般來說菌種培養(yǎng)穩(wěn)定后才能用于您的后續(xù)實驗。
3、初次使用時請嚴格按照本說明書推薦條件和操作步驟進行復活培養(yǎng)，如使用其它類型培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件造成菌種不活等損失，我單位不負責任。
4、恢復培養(yǎng)厭氧菌時，在操作過程中應嚴格控制厭氧條件：制作培養(yǎng)基時，應使用厭氧螺口試管，并利用高純氮氣去除試管和培養(yǎng)基中的氧氣，使用者應保證菌種的安全存儲和操作，帶菌廢棄物應高壓滅菌處理后丟棄。
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