大鼠骨膜干細胞的運輸和保存及培養(yǎng)操作規(guī)程！
小楊 / 2024-03-20 09:29:20
一、細胞簡介
規(guī)格：5×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細胞信息：原代細胞
細胞用途：研究
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
二、細胞詳述
骨膜是覆蓋在骨質(zhì)表面的一層結(jié)締組織。骨膜通過夏皮式纖維錨定在骨質(zhì)上，充當(dāng)外部肌肉組織和內(nèi)部骨質(zhì)的連接橋梁，這種結(jié)構(gòu)有助于維持骨膜的完整性。
骨膜由兩部分組成，外層疏松的纖維層與內(nèi)層致密的細胞層，纖維層中含有成纖維細胞、膠原纖維、彈力纖維及微管等。細胞層中多為骨膜源干細胞，這種干細胞與骨髓來源的間充質(zhì)干細胞類似，具有多向分化的潛能。
骨質(zhì)修復(fù)、重塑和更新與骨膜中的干細胞密切相關(guān)。在正常生理狀況下，骨膜組織發(fā)揮著維持骨質(zhì)更新及重塑的作用，其中的干細胞既可以通過膜內(nèi)成骨方式分化為成骨細胞，也可通過軟骨內(nèi)成骨方式分化為軟骨細胞。
三、細胞特性
1)細胞來源于實驗動物正常關(guān)節(jié)骨膜組織。
2)細胞鑒定：CD90或CD73免疫熒光染色為陽性。
3)經(jīng)鑒定細胞純度高于90%。
4)不含有 HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
5)細胞生長方式：成纖維樣細胞，貼壁培養(yǎng)。
四、產(chǎn)品的運輸和保存
視天氣狀況和運輸距離遠近，公司與客戶協(xié)商后選擇下述方式中的一種進行。
1)1mL凍存細胞懸液裝于1.8ml的凍存管中，置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸；收到細胞后請盡快解凍復(fù)蘇細胞進行培養(yǎng)，如無法立刻進行復(fù)蘇操作，凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月。
2)T-25培養(yǎng)瓶充滿完全培養(yǎng)基后進行常溫運輸；收到細胞后請鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作，如懸浮的細胞較多，請將培養(yǎng)瓶至于培養(yǎng)箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁。
五、產(chǎn)品使用
1)本產(chǎn)品僅能用于科研
2)本產(chǎn)品未通過直接用于活體動物和人的審核
3)本產(chǎn)品未通過用于活體診斷的審核
六、細胞接收后的處理方法
1）收到細胞后，請檢查發(fā)貨培養(yǎng)瓶的狀況，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯(lián)系我們。
2）在顯微鏡下確認細胞生長狀態(tài)時，最好在低倍鏡（4或5X物鏡)下進行，能準(zhǔn)確判斷細胞的傳代密度。看細胞的形態(tài)請在10X和20×物鏡下，同時給剛收到的細胞拍照，（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為細胞需要售后時提供收到細胞時細胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）觀察好細胞狀態(tài)后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h。
4）貼壁細胞：在運輸過程中貼壁細胞會有脫落的現(xiàn)象，如發(fā)現(xiàn)貼壁細胞有脫落或者脫落后抱團生長，可將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和未貼壁細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到加有按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基的原培養(yǎng)瓶中（或新的培養(yǎng)瓶中）。
5）懸浮細胞：T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，然后抽出瓶中的培養(yǎng)基和細胞1000rpm離心5分鐘，棄去上清重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶中（加入按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基）。
6）備注：運輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來培養(yǎng)細胞，請換用按照說明書細胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細胞。收到細胞后第一次傳代建議 1：2 傳代。
七、細胞培養(yǎng)步驟
1、培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：
1）準(zhǔn)備 MEGM kit 培養(yǎng)基 （Lonza/Clonetics,CC-3150）備注：培養(yǎng)基包含（A+B）
A：MEBM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液
B: 細胞生長添加劑 5 管 5 管
霍亂毒素（cholera toxin） (100ng/ml) 500 ul
P/S 青霉素-鏈霉素 5 ml
2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為 70%-80%。
3）凍存液：92.5%完全培養(yǎng)基，7.5%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
2、細胞處理：
1）復(fù)蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，離心管加入 4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在 800-1000RPM 條件下離心 4-5 分鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，補加培養(yǎng)基至 6ml。24-48h 后換液。
2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。
2.加 1ml 消化液（0.25%Trypsin）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培養(yǎng)箱中消化 1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加 1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 5 分鐘，棄去上清液，加 1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按 1：3 到 1:4 比例分到新的含 6ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
注：第一次傳代推薦傳代比例為 1:2，以后傳代比例可根據(jù)客戶需要自己決定。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面 T25 瓶為類；
1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細胞變圓脫落后，加入 1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、4min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 完全培養(yǎng)基重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 7.5%，細胞密度 1-2xE6/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，至少 2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
八、注意事項
1、收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。
2、所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。
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