酵母基因組DNA提取試劑盒的純度檢測(cè)與操作方法！
小楊 / 2024-04-16 08:54:24
一、背景
酵母基因組DNA提取試劑盒采用DNA吸附柱和獨(dú)有的溶液系統(tǒng)，適合于從多種來(lái)源的酵母培養(yǎng)物中快速簡(jiǎn)單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生長(zhǎng)期的酵母培養(yǎng)液一般一次抽提可純化出10-15μg的高質(zhì)量的基因組DNA。純化DNA產(chǎn)物可直接用于PCR、酶切和雜交等實(shí)驗(yàn)。
酵母細(xì)胞經(jīng)lyticase處理去除細(xì)胞壁后，獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
二、原理
采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞并結(jié)合破壁酶特異消化酵母細(xì)胞壁，能在1小時(shí)內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后,加入破壁酶去除細(xì)胞壁后,然后堿裂法裂解細(xì)胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
三、產(chǎn)品特點(diǎn)
1、離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好。克服了國(guó)產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。
2、不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
3、快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品裂解后操作一般可在30分鐘內(nèi)完成。
4、多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。
四、操作方法
酵母細(xì)胞經(jīng)lyticase處理去除細(xì)胞壁后，獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜，再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物，蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。
五、保存條件
室溫保存，12個(gè)月內(nèi)有效。ProteinaseK與Lyticase-20℃保存。
六、純度檢測(cè)
基因組DNA片段的大小與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。提取的DNA片段可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。可配制0.8-1.0％瓊脂糖凝膠，使用λ/HindIII判斷基因組的大小，完整的基因組大小應(yīng)在23kb以上。使用分光光度計(jì)檢測(cè)時(shí)，OD260/OD280比值應(yīng)為1.7–1.9之間，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水洗脫，比值可能偏低，但并不表明DNA純度不高。
七、注意事項(xiàng)
1、樣品應(yīng)避免反復(fù)凍融，否則會(huì)導(dǎo)致提取的片段較小且提取量下降。
2、若試劑盒中的溶液出現(xiàn)沉淀，可在65度水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。
3、洗脫緩沖液的體積好不少于50ul，體積過(guò)小會(huì)影響回收效率；洗脫液的值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。
八、應(yīng)用
在光滑球擬酵母基因組規(guī)模生物模型的構(gòu)建與應(yīng)用研究中以丙酮酸工業(yè)生產(chǎn)菌株Candida glabrata CCTCC M202019為研究模型,在完成全基因組測(cè)序、基因組功能注釋和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型(Genome-scale metabolic model,GSMM)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型(Transcriptional regulatory network,TRN)和工業(yè)微生物輔因子代謝網(wǎng)絡(luò)模型(Genome-scale cofactor metabolic model,GSCMM)。
結(jié)合上述基因組規(guī)模生物模型,運(yùn)用基于約束的優(yōu)化算法,從基因、代謝、轉(zhuǎn)錄、輔因子等層面上解析了C.glabrata的生理特征(如丙酮酸的高產(chǎn)、低致病性相關(guān)的生物安全性等),并發(fā)展了優(yōu)化其生產(chǎn)性能(如丙酮酸、富馬酸等丙酮酸去路中代謝物)的方法。
主要研究結(jié)果如下:1.運(yùn)用二代高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)C.glabrata CCTCC M202019進(jìn)行全基因組測(cè)序,其基因組特征包括:12.1 Mbp基因組大小、38.47%GC含量、5345個(gè)基因、191個(gè)t RNA、6個(gè)r RNA和1.15%的重復(fù)序列等。與C.glabrata CBS138進(jìn)行比較基因組分析,發(fā)現(xiàn)雖然兩菌基因組具有高度相似性,但也存在差異如:中心碳代謝(營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和二羧酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化磷酸化和丙酮酸分解代謝)和黏附性代謝(凝集素蛋白的低復(fù)雜度重復(fù)區(qū)和功能結(jié)構(gòu)域的缺失和變化)。
在此基礎(chǔ)上,借助在四種培養(yǎng)基上的丙酮酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、哥倫比亞血平板上生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、96孔微孔板內(nèi)壁和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附實(shí)驗(yàn),證明了C.glabrata CCTCC M202019比CBS138菌株具有更強(qiáng)的丙酮酸生產(chǎn)能力和更弱的黏附性和細(xì)胞毒性。2.根據(jù)C.glabrata氨基酸序列、文獻(xiàn)挖掘和專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建了C.glabrata的GSMM i NX804。模型i NX804包括804個(gè)基因、1025個(gè)代謝物和1287個(gè)生化反應(yīng),分布于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過(guò)氧化物酶體、高爾基體、液泡和胞外區(qū)間。
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