細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染現(xiàn)象與檢測(cè)方法及處理與預(yù)防措施！
小楊 / 2025-03-21 09:59:32
百歐博偉生物：細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染是實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)且具有挑戰(zhàn)性的問(wèn)題。支原體（Mycoplasma）是一類微小的原核生物，缺乏細(xì)胞壁，對(duì)常規(guī)抗生素（如青霉素）不敏感，因此污染后難以清除且容易被忽視。
以下是關(guān)于支原體污染的詳細(xì)解析：
一、支原體污染的特點(diǎn)
1、隱蔽性強(qiáng)：支原體直徑僅0.2-0.3 μm，可通過(guò)常規(guī)濾膜（如0.22 μm濾器），污染初期無(wú)明顯細(xì)胞形態(tài)變化。
2、代謝干擾：支原體依賴宿主細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)，長(zhǎng)期污染會(huì)改變細(xì)胞代謝，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢、基因表達(dá)異?；?qū)嶒?yàn)結(jié)果偏差。
3、傳播途徑廣：
人員操作：實(shí)驗(yàn)人員攜帶（如唾液、皮膚接觸）；
試劑污染：血清、培養(yǎng)基或消化酶被污染；
交叉污染：已污染的細(xì)胞系傳播至其他培養(yǎng)物。
二、污染的可能表現(xiàn)
1、直接觀察：
細(xì)胞狀態(tài)逐漸變差（如生長(zhǎng)遲緩、貼壁性下降）；
培養(yǎng)液輕微渾濁（需與細(xì)菌污染區(qū)分）；
細(xì)胞核異常（如碎片增多、核周空泡）。
2、間接影響：
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)異常（如轉(zhuǎn)染效率下降、凋亡率升高）；
細(xì)胞周期或代謝相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可重復(fù)。
三、檢測(cè)方法
1、PCR法：特異性引物擴(kuò)增支原體DNA（如16S rRNA基因），靈敏度高，可快速檢測(cè)（常用商業(yè)試劑盒）。
2、熒光染色法：Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡觀察，支原體附著在細(xì)胞表面呈細(xì)小藍(lán)色顆粒。
3、培養(yǎng)法：將樣本接種于支原體專用培養(yǎng)基，耗時(shí)較長(zhǎng)（數(shù)周），但特異性高。
4、ELISA或電鏡：較少常規(guī)使用，適用于特定研究。
四、污染處理措施
1、立即隔離：將污染細(xì)胞與其他培養(yǎng)物分開(kāi)，避免交叉污染。
2、徹底清除：
丟棄污染細(xì)胞：建議直接廢棄珍貴性不高的污染細(xì)胞；
抗生素處理：使用支原體特異性抗生素（如Plasmocin™、BM-Cyclin），需注意：
治療周期長(zhǎng)（2-3周），可能誘導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激；
無(wú)法100%清除，需后續(xù)嚴(yán)格檢測(cè)。
3、環(huán)境消毒：用支原體殺滅劑（如Mynox®）處理培養(yǎng)箱、超凈臺(tái)等。
五、預(yù)防策略
1、嚴(yán)格無(wú)菌操作：
佩戴口罩和手套，避免說(shuō)話或觸碰培養(yǎng)液；
定期更換水浴鍋中的水，并添加抑菌劑。
2、試劑質(zhì)量控制：
選擇經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)的血清和培養(yǎng)基；
分裝試劑，避免反復(fù)凍融污染。
3、定期檢測(cè)：
新購(gòu)入細(xì)胞系必須檢測(cè)；
每1-2個(gè)月對(duì)常用細(xì)胞進(jìn)行抽檢。
4、細(xì)胞庫(kù)管理：
凍存原始細(xì)胞種子庫(kù)，避免長(zhǎng)期傳代增加污染風(fēng)險(xiǎn)；
新細(xì)胞系需在獨(dú)立培養(yǎng)箱中隔離培養(yǎng)1個(gè)月。
六、支原體污染的潛在后果
科研影響：導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠或數(shù)據(jù)發(fā)表后被質(zhì)疑；
經(jīng)濟(jì)損失：污染可能導(dǎo)致珍貴細(xì)胞系丟失或?qū)嶒?yàn)重復(fù)；
生物安全風(fēng)險(xiǎn)：某些支原體（如M. fermentans）可能對(duì)人體有害。
七、總結(jié)
支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中的“隱形殺手”，防控需結(jié)合嚴(yán)格的操作規(guī)范、定期檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室管理。一旦發(fā)現(xiàn)污染，需果斷處理并追溯污染源。建議實(shí)驗(yàn)室建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP），并培訓(xùn)人員提高防范意識(shí)。對(duì)于關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)，可考慮使用支原體檢測(cè)陰性的認(rèn)證細(xì)胞系（如ATCC提供的細(xì)胞）。
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