微生物限度檢測儀的實驗前準(zhǔn)備與操作規(guī)程及注意事項！
小楊 / 2025-06-16 10:00:15
百歐博偉生物：使用微生物限度檢測儀（通常指薄膜過濾法使用的集菌儀或類似設(shè)備）進(jìn)行藥品、醫(yī)療器械、化妝品、食品等產(chǎn)品的微生物限度檢查時，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程至關(guān)重要，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和操作人員的安全。以下是關(guān)鍵的操作規(guī)程和注意事項：
一、實驗前準(zhǔn)備
1、環(huán)境準(zhǔn)備:
必須在符合要求的潔凈環(huán)境中進(jìn)行操作，通常是B級背景下的A級單向流空氣區(qū)域（如超凈工作臺或生物安全柜）。
提前開啟超凈臺/生物安全柜和室內(nèi)空調(diào)凈化系統(tǒng)，運行足夠時間（通常≥30分鐘）以達(dá)到潔凈度要求。
用適宜的消毒劑對工作臺面、設(shè)備表面（尤其接觸部位）進(jìn)行徹底擦拭消毒。
限制人員進(jìn)出，減少走動和交談，避免污染。
2、人員準(zhǔn)備:
穿戴潔凈的無菌實驗服/連體服、口罩、帽子和無菌手套。必要時佩戴護(hù)目鏡。
用消毒劑對手部進(jìn)行消毒，并在操作過程中定期消毒或更換手套。
所有進(jìn)入潔凈區(qū)的物品必須經(jīng)過消毒處理。
3、儀器與耗材準(zhǔn)備:
儀器檢查：檢查集菌儀是否運行正常（真空度、蠕動泵轉(zhuǎn)速等），管路是否連接正確、無泄漏、無污染。確認(rèn)儀器已清潔消毒。
耗材滅菌：
濾杯/濾頭：必須經(jīng)過有效的滅菌處理（如濕熱滅菌121℃ 15分鐘）。使用時確保在無菌狀態(tài)下打開包裝。
濾膜：選擇孔徑0.45µm（或標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定）的適宜材質(zhì)（如混合纖維素酯）濾膜，必須無菌。使用時用無菌鑷子夾取，避免觸碰濾膜中央過濾區(qū)域。
培養(yǎng)皿：準(zhǔn)備無菌的塑料或玻璃培養(yǎng)皿（用于放置濾膜）。
沖洗液：準(zhǔn)備足量、無菌的稀釋液或沖洗液（如0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液）。
其他：無菌鑷子、無菌剪刀、無菌注射器、無菌樣品容器、消毒劑、記號筆等。
4、樣品準(zhǔn)備:
按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程接收、登記和儲存樣品。
在潔凈環(huán)境下，使用無菌工具和方法對樣品進(jìn)行無菌處理（如消毒包裝表面、無菌開啟、無菌稱量或量?。?。
根據(jù)產(chǎn)品特性和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，將樣品溶解或稀釋到適宜的濃度（通常使微生物負(fù)荷在可計數(shù)范圍內(nèi)）。
二、操作過程
1、組裝無菌過濾裝置:
在超凈臺/生物安全柜內(nèi)，進(jìn)行無菌操作。
打開無菌濾杯/濾頭的包裝。
用無菌鑷子小心取出一張無菌濾膜，有網(wǎng)格面向上（利于菌落觀察計數(shù)），放置在濾杯底座的支撐篩板上。確保濾膜平整無皺褶。
將濾杯上蓋（或漏斗部分）對準(zhǔn)底座旋緊或卡緊，確保密封。整個過濾裝置組裝過程應(yīng)快速、無菌。
2、連接儀器:
將組裝好的無菌濾杯連接到集菌儀的抽濾接口上。
將濾杯的排液管出口端放入廢液收集瓶中（廢液瓶內(nèi)應(yīng)有消毒液）。
將沖洗液瓶通過無菌管路連接到濾杯的進(jìn)液口（如果是蠕動泵進(jìn)液模式）。
確保所有連接緊密無泄漏。
3、樣品過濾:
用無菌注射器吸取規(guī)定體積的樣品溶液（或樣品稀釋液）。
將注射器連接到濾杯的樣品注入口（如有），或打開進(jìn)液口蓋，將樣品溶液無菌轉(zhuǎn)移到濾杯中。
啟動集菌儀，施加適當(dāng)?shù)呢?fù)壓或啟動蠕動泵，使樣品溶液通過濾膜?？刂屏魉?，避免過快導(dǎo)致微生物截留不完全或濾膜破損。
樣品溶液完全通過濾膜后，停止抽濾/泵。
4、沖洗濾膜:
此步驟至關(guān)重要，目的是洗去濾膜上可能殘留的抑菌成分。
用無菌注射器或通過沖洗液管路，向濾杯中加入規(guī)定體積（通常每次100ml）的無菌沖洗液。
啟動儀器，使沖洗液通過濾膜。重復(fù)沖洗操作規(guī)定的次數(shù)（通常3次 x 100ml，或根據(jù)驗證結(jié)果確定）。每次沖洗應(yīng)讓沖洗液完全流干。
注意：沖洗液體積和次數(shù)必須經(jīng)過方法適用性驗證確認(rèn)，確保能有效消除產(chǎn)品的抑菌性。
5、過濾陽性對照/供試品對照（如適用）:
按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，同時操作陽性對照（加入已知少量菌的樣品溶液）和供試品對照（僅過濾沖洗液，檢查無菌操作和沖洗液無菌性）。
6、轉(zhuǎn)移濾膜:
過濾和沖洗完成后，關(guān)閉真空或停止泵。
小心地拆卸濾杯，避免觸碰濾膜。
用無菌鑷子輕輕夾起濾膜的邊緣，將其從底座上取下。
將濾膜有菌面向上（即過濾時朝上的網(wǎng)格面），平整地貼放在預(yù)先準(zhǔn)備好的無菌培養(yǎng)皿中預(yù)先傾倒好的固體培養(yǎng)基表面（如
營養(yǎng)瓊脂用于需氧菌總數(shù)，
沙氏葡萄糖瓊脂用于霉菌和酵母菌總數(shù)）。確保濾膜與培養(yǎng)基之間無氣泡。
注意：此步驟操作要快且準(zhǔn)，避免環(huán)境微生物污染濾膜。
7、培養(yǎng):
將貼有濾膜的培養(yǎng)皿倒置（防止冷凝水滴落影響菌落生長）。
放入規(guī)定溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：
需氧菌總數(shù) (TAMC)：通常貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30-35℃培養(yǎng)不少于3天（通常3-5天）。
霉菌和酵母菌總數(shù) (TYMC)：通常貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，20-25℃培養(yǎng)不少于5天（通常5-7天）。
培養(yǎng)時間需根據(jù)驗證結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定執(zhí)行。
8、過濾下一個樣品:
如需檢測多個樣品，必須更換整套無菌過濾裝置（濾杯/濾頭、濾膜）和連接管路（或徹底消毒），避免交叉污染。
對設(shè)備接觸過樣品的部分（如濾杯接口）進(jìn)行消毒（如用75%乙醇擦拭）。
三、操作后處理
1、儀器清潔與消毒:
實驗結(jié)束后，立即對集菌儀表面進(jìn)行清潔消毒。
對接觸過樣品的部件（如濾杯接口、可能接觸樣品的管路）進(jìn)行徹底清潔和消毒?？刹鹦恫考?yīng)按SOP進(jìn)行清洗和濕熱滅菌。不可拆卸管路需用適宜消毒劑充分沖洗，再用注射用水或純化水沖洗干凈，最后用75%乙醇沖洗并干燥（具體方法依據(jù)設(shè)備說明書和驗證結(jié)果）。
排空并清潔消毒廢液瓶。
2、廢物處理:
使用過的濾杯、濾膜、培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、樣品容器、一次性耗材等，均視為生物廢棄物。
必須放入專用的、防滲漏的生物危害廢物袋/容器中。
按照實驗室生物安全規(guī)定和廢棄物處理SOP進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121℃, 30分鐘以上）或化學(xué)消毒后，再交由有資質(zhì)的機構(gòu)處理。嚴(yán)禁隨意丟棄！
3、環(huán)境清潔:
清潔消毒工作臺面、地面及其他可能污染的區(qū)域。
記錄清潔消毒情況。
四、記錄與報告
1、詳細(xì)記錄：操作全過程的關(guān)鍵信息，包括：
日期、時間、操作人員。
使用的儀器名稱、編號、狀態(tài)。
樣品信息（名稱、批號、規(guī)格）。
樣品處理過程（稀釋方法、體積）。
使用的濾膜批號、培養(yǎng)基批號及適用性檢查結(jié)果。
過濾體積、沖洗液種類、體積及次數(shù)。
培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、開始培養(yǎng)時間）。
培養(yǎng)結(jié)果觀察記錄（菌落計數(shù)、形態(tài)描述）。
實驗過程中出現(xiàn)的任何偏差或異常情況。
清潔消毒記錄。
2、結(jié)果計算與報告：根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果，按照規(guī)定方法計算每單位樣品（如每克、每毫升、每件）的需氧菌總數(shù)和霉菌酵母菌總數(shù)，出具檢測報告。結(jié)果報告應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的要求。
五、關(guān)鍵注意事項與安全
無菌操作是核心：整個操作過程必須貫穿嚴(yán)格的無菌觀念，所有接觸樣品、濾膜、培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿的步驟都必須在A級潔凈區(qū)進(jìn)行，并使用無菌器具。
生物安全防護(hù)：微生物限度檢測涉及潛在病原微生物。操作者必須穿戴適當(dāng)?shù)膫€人防護(hù)裝備（PPE），嚴(yán)格遵守實驗室生物安全規(guī)定。處理廢棄物時尤其要小心。
方法驗證：薄膜過濾法必須經(jīng)過方法適用性驗證，確認(rèn)供試品在該方法下無抑菌作用或抑菌作用可被有效消除（通過沖洗），且驗證所用的沖洗液體積和沖洗次數(shù)適用于日常檢測。未經(jīng)驗證的方法結(jié)果不可靠。
防止交叉污染：不同樣品之間必須徹底清潔消毒設(shè)備接觸面或更換耗材。陽性對照操作要特別小心，防止污染環(huán)境和其他樣品。
濾膜完整性：操作中注意控制負(fù)壓/流速，防止濾膜破損。過濾后檢查濾膜是否完好。
設(shè)備校準(zhǔn)與維護(hù)：定期對集菌儀（真空度、泵速等）、培養(yǎng)箱（溫度）進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保其性能可靠。
遵守SOP：嚴(yán)格執(zhí)行實驗室制定的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）、藥典或相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。
牢記：微生物限度檢測結(jié)果的可靠性直接關(guān)系到產(chǎn)品的安全性評價。任何操作上的疏忽都可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果，因此必須嚴(yán)謹(jǐn)、細(xì)致、規(guī)范地執(zhí)行每一步操作規(guī)程。操作前務(wù)必仔細(xì)閱讀設(shè)備說明書和實驗室的相關(guān)SOP，并接受充分的培訓(xùn)。
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