實(shí)驗(yàn)室空白對照平板長菌的原因分析方向與排查步驟！
小楊 / 2025-06-20 10:01:46
百歐博偉生物：空白對照平板長出菌落，這是一個(gè)非常嚴(yán)重的問題，它直接質(zhì)疑了你整個(gè)實(shí)驗(yàn)的無菌操作和結(jié)果的可靠性。必須進(jìn)行徹底的原因分析。以下是一個(gè)系統(tǒng)性的分析思路和排查步驟：
一、核心原則
空白對照的目的是監(jiān)測整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中是否存在污染。如果空白長菌，說明在從滅菌到培養(yǎng)結(jié)束的某個(gè)或多個(gè)環(huán)節(jié)引入了污染物（通常是細(xì)菌或真菌孢子）。
二、原因分析方向與排查步驟
1、培養(yǎng)基滅菌不徹底 (最常見原因之一)
排查：
滅菌鍋驗(yàn)證：最近一次滅菌鍋的生物指示劑測試（如
嗜熱脂肪芽孢桿菌條）是否合格？物理監(jiān)測（溫度、壓力、時(shí)間）記錄是否完整且符合要求？
裝載方式：滅菌時(shí)培養(yǎng)基是否裝載過密？是否阻礙了蒸汽穿透？滅菌鍋排水口是否通暢？
滅菌參數(shù)：滅菌溫度、壓力、時(shí)間是否設(shè)置正確并準(zhǔn)確執(zhí)行？是否達(dá)到121°C至少15分鐘？
冷卻過程：滅菌后培養(yǎng)基是否在超凈臺(tái)內(nèi)冷卻？在冷卻過程中，容器是否密封？如果在水浴中冷卻，水浴鍋是否干凈？水面是否低于容器口？
2、平板傾注/操作過程中的污染 (最常見原因之一)
排查：
超凈臺(tái)/生物安全柜：
使用前是否開啟足夠時(shí)間（通常15-30分鐘）進(jìn)行自凈？風(fēng)速是否正常（定期檢測）？
高效過濾器是否過期？是否定期檢測和更換？
臺(tái)面是否徹底清潔消毒（使用前后）？是否有液體殘留？
操作時(shí)臺(tái)內(nèi)物品是否擺放過多、過亂，阻礙了氣流？是否頻繁、大幅度地進(jìn)出操作區(qū)？
操作時(shí)是否在正確的"潔凈區(qū)域"（通常離前窗10-15cm以內(nèi)）進(jìn)行？
操作者：
無菌操作規(guī)范是否嚴(yán)格遵守？是否戴手套、口罩？是否用酒精消毒手套？
動(dòng)作是否過大、過快，引起氣流紊亂？
是否在操作過程中說話、咳嗽、打噴嚏？(這是常見污染源)
手臂是否頻繁越過敞開的平板/培養(yǎng)基上方？
無菌器具：
用于傾注的培養(yǎng)瓶口、移液管、吸頭等是否在火焰上充分灼燒滅菌？
移液器是否可能被污染？(尤其是吸液操作時(shí))
平板蓋子打開的角度是否過大？暴露時(shí)間是否過長？
倒平板時(shí)，培養(yǎng)瓶口是否觸碰了平板邊緣或外部環(huán)境？
3、無菌水/稀釋液污染
排查：
用于制備空白對照的無菌水/緩沖液是否確實(shí)無菌？其滅菌記錄和保存條件如何？
分裝容器是否無菌？是否在超凈臺(tái)內(nèi)分裝？
開啟后是否在規(guī)定時(shí)間內(nèi)使用？是否被污染？
4、平板本身或包裝問題
排查：
購買的一次性無菌平板，包裝是否完好無損？有無破損、受潮？
是否在有效期內(nèi)？
如果是自制的平板，培養(yǎng)皿滅菌是否徹底？
5、培養(yǎng)箱污染
排查：
培養(yǎng)箱內(nèi)部是否定期清潔消毒？是否有冷凝水積聚？（冷凝水是很好的污染源）
培養(yǎng)箱內(nèi)的擱架、隔板是否干凈？是否有多余的培養(yǎng)基殘留？
培養(yǎng)箱的密封性是否良好？空氣過濾裝置（如有）是否有效？
是否同時(shí)培養(yǎng)了大量高濃度微生物樣品？存在氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)？
6、環(huán)境因素
排查：
實(shí)驗(yàn)室整體環(huán)境是否清潔？是否有大量揚(yáng)塵？
超凈臺(tái)放置的位置是否合理？是否處于人員頻繁走動(dòng)、門開關(guān)頻繁或氣流紊亂的區(qū)域？
實(shí)驗(yàn)室的HVAC系統(tǒng)（通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)）是否正常運(yùn)行？壓差是否符合要求（特別是無菌操作區(qū)域應(yīng)為正壓）？
7、其他容易被忽視的因素
滅菌鍋排水不暢：導(dǎo)致滅菌鍋底部積水，溫度達(dá)不到要求。
滅菌鍋冷空氣未排盡：導(dǎo)致局部溫度不夠。
培養(yǎng)基成分：某些特殊成分在高溫滅菌后分解產(chǎn)生顆粒，被誤認(rèn)為是菌落（需顯微鏡確認(rèn)）。
冷凝水污染：倒好的平板在冷卻過程中，蓋子內(nèi)壁產(chǎn)生冷凝水，如果操作不當(dāng)，冷凝水滴落至培養(yǎng)基表面可能帶入污染物。
操作臺(tái)表面消毒劑失效：使用的酒精濃度不足（應(yīng)70-75%）或已揮發(fā)失效。
三、如何確定具體原因？
1、回顧記錄：仔細(xì)檢查實(shí)驗(yàn)記錄，包括滅菌參數(shù)、操作過程描述、環(huán)境溫濕度等。
2、重現(xiàn)實(shí)驗(yàn) (非常重要)：
單獨(dú)滅菌培養(yǎng)基：單獨(dú)滅菌一批培養(yǎng)基，不做任何操作，直接倒空白平板培養(yǎng)。如果長菌，問題在滅菌或平板本身。
空白操作測試：在超凈臺(tái)內(nèi)，使用無菌水（確認(rèn)無菌）進(jìn)行模擬樣品處理的所有操作步驟（如稀釋、移液、傾注），培養(yǎng)空白對照。如果長菌，問題在操作過程或超凈臺(tái)。
環(huán)境監(jiān)測：在操作期間，在超凈臺(tái)內(nèi)不同位置放置打開的TSA平板暴露一定時(shí)間（如30分鐘），然后蓋上培養(yǎng)，看是否長菌以及菌落分布，評估超凈臺(tái)潔凈度。
培養(yǎng)箱監(jiān)測：在培養(yǎng)箱不同位置放置打開的TSA平板暴露一定時(shí)間（如15-30分鐘），蓋上培養(yǎng)，檢查是否長菌。
3、菌落形態(tài)觀察：觀察空白對照上的菌落形態(tài)、顏色、大小是否一致？如果形態(tài)多樣，說明污染源復(fù)雜；如果形態(tài)單一，可能指向特定污染源（如操作者口腔菌、環(huán)境中的特定菌）。這有助于縮小范圍。
4、系統(tǒng)檢查設(shè)備：
超凈臺(tái)：檢測風(fēng)速、高效過濾器完整性（PAO/DOP測試）。
滅菌鍋：進(jìn)行物理驗(yàn)證（溫度探頭）和生物指示劑驗(yàn)證。
培養(yǎng)箱：清潔消毒，檢查溫濕度均勻性。
5、檢查耗材和試劑：確認(rèn)無菌水、緩沖液、一次性平板的無菌性（可抽樣培養(yǎng)測試）。
四、總結(jié)與建議
立即暫停相關(guān)實(shí)驗(yàn)！直到問題解決。
系統(tǒng)性排查：按照上述方向逐一排查，不要遺漏任何環(huán)節(jié)。
重視重現(xiàn)測試：這是鎖定問題來源最有效的方法。
加強(qiáng)記錄：所有操作、設(shè)備參數(shù)、維護(hù)、驗(yàn)證都必須有詳細(xì)記錄，便于追溯。
強(qiáng)化培訓(xùn)：確保所有操作人員都經(jīng)過嚴(yán)格的無菌操作培訓(xùn)并理解其重要性。
定期維護(hù)與驗(yàn)證：對關(guān)鍵設(shè)備（超凈臺(tái)、滅菌鍋、培養(yǎng)箱）進(jìn)行定期維護(hù)、清潔和性能驗(yàn)證。
建立SOP并嚴(yán)格遵守：詳細(xì)的無菌操作標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）是保證無菌的基礎(chǔ)。
找出空白污染的原因需要耐心和細(xì)致。通過科學(xué)的方法逐步排查，一定能找到污染源并加以解決，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
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