細(xì)胞實驗如何選擇培養(yǎng)基和進(jìn)行換液操作的詳細(xì)指南！
小楊 / 2025-06-20 10:21:04
百歐博偉生物：在細(xì)胞實驗中，“選細(xì)胞液”通常指的是選擇適合你培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基（Cell Culture Medium），而“換液”（Media Change）則是更換培養(yǎng)容器中舊培養(yǎng)基為新培養(yǎng)基的過程。這兩者緊密相關(guān)，選擇正確的培養(yǎng)基是換液操作的基礎(chǔ)和前提。以下是如何選擇培養(yǎng)基和進(jìn)行換液操作的詳細(xì)指南：
一、如何選擇培養(yǎng)基（“細(xì)胞液”）
選擇培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵第一步。沒有“萬能”的培養(yǎng)基，選擇取決于：
細(xì)胞類型：
細(xì)胞來源物種：人源、小鼠、大鼠等。
細(xì)胞種類：是原代細(xì)胞（直接從組織分離）還是已建立的細(xì)胞系？是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞？是正常細(xì)胞還是癌細(xì)胞？是干細(xì)胞還是分化細(xì)胞？
查找文獻(xiàn)/數(shù)據(jù)庫：
查閱文獻(xiàn)：查找研究同類型細(xì)胞的已發(fā)表論文，看他們使用什么培養(yǎng)基。
ATCC/DSMZ/ECACC等細(xì)胞庫：這些權(quán)威機(jī)構(gòu)會為它們保存的每一株細(xì)胞提供詳細(xì)的培養(yǎng)條件說明，包括推薦的培養(yǎng)基、血清類型和濃度、添加劑等。這是最可靠的信息來源！
基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類：
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)：應(yīng)用最廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一，適用于多種貼壁細(xì)胞。有高糖（4500mg/L）和低糖（1000mg/L）版本，高糖更常用。
MEM (Minimum Essential Medium)：歷史悠久的培養(yǎng)基，成分相對簡單，適用于多種細(xì)胞。
RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640)：最初為淋巴細(xì)胞設(shè)計，現(xiàn)在廣泛用于懸浮細(xì)胞和某些貼壁細(xì)胞。
IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium)：在DMEM基礎(chǔ)上改良，血清需求較低，常用于造血細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等。
McCoy's 5A：適用于多種原代細(xì)胞和癌細(xì)胞系（如
卵巢癌細(xì)胞）。
Stem Cell專用培養(yǎng)基：專為維持胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞未分化狀態(tài)設(shè)計，成分明確，通常不含血清。
無血清培養(yǎng)基：成分明確，不含動物來源成分，用于需要精確控制培養(yǎng)條件、減少批次差異、下游應(yīng)用或研究特定因子作用的實驗。需要添加特定的生長因子、激素、載體蛋白等。
血清：
類型：胎牛血清是最常用的（FBS/FCS），提供豐富的生長因子、激素、粘附因子、營養(yǎng)物質(zhì)。有時也使用新生牛血清、馬血清等。
濃度：通常添加5%-20%，最常見是10%。濃度過高可能促進(jìn)分化或抑制某些細(xì)胞生長；過低則可能無法支持細(xì)胞良好生長。必須參考細(xì)胞庫或文獻(xiàn)的具體推薦。
批次：血清是天然產(chǎn)物，批次間差異顯著。強(qiáng)烈建議：
預(yù)先測試：對新批次血清進(jìn)行細(xì)胞生長曲線、克隆形成率等測試。
大量購買同一批次：一旦選定合適批次，盡量購買足夠長時間使用的量。
熱滅活：56°C水浴30分鐘，滅活補(bǔ)體。并非所有細(xì)胞都需要！僅在特定實驗（如免疫學(xué)研究、某些病毒培養(yǎng)、或已知該批次血清對細(xì)胞有毒性時）進(jìn)行。熱滅活會損失部分生長因子。
添加劑：
抗生素：常用青霉素-鏈霉素雙抗（Pen-Strep），濃度通常為50-100 U/mL青霉素 + 50-100 µg/mL鏈霉素。用于防止細(xì)菌污染。注意： 長期使用抗生素可能掩蓋低水平污染或誘導(dǎo)細(xì)胞抗性。無菌操作熟練后，可在某些實驗（如原代培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染前）考慮不加。
抗真菌劑：如兩性霉素B、制霉菌素等，僅在懷疑或處理真菌污染時短期使用，對細(xì)胞可能有毒性。
L-谷氨酰胺：細(xì)胞重要碳源和氮源，不穩(wěn)定（在4°C和37°C下會降解）?；A(chǔ)培養(yǎng)基中通常已含，但需注意有效期。使用時額外添加（終濃度2-4mM）或使用穩(wěn)定的GlutaMAX添加劑。
HEPES緩沖液：在CO2培養(yǎng)箱環(huán)境外提供更好的pH緩沖能力（如顯微鏡觀察、操作時間較長時），常用濃度10-25mM。
丙酮酸鈉：能量來源，對某些細(xì)胞有益。
非必需氨基酸：補(bǔ)充營養(yǎng)。
β-巰基乙醇：抗氧化劑，常用于雜交瘤和干細(xì)胞培養(yǎng)。
特定生長因子/細(xì)胞因子：在無血清或低血清培養(yǎng)中尤其重要。
實驗?zāi)康模?/strong>
維持培養(yǎng)：選擇能支持細(xì)胞穩(wěn)定增殖的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。
誘導(dǎo)分化：需要換成特定的分化培養(yǎng)基（成分不同，常不含或含低濃度血清，添加特定誘導(dǎo)因子）。
轉(zhuǎn)染：某些培養(yǎng)基血清和蛋白含量低，可提高轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后需要換回完全培養(yǎng)基。
藥物處理/刺激實驗：可能需要使用無血清或低血清培養(yǎng)基一段時間（血清饑餓同步化），以減少血清中未知因子的干擾。處理時也常在無/低血清培養(yǎng)基中進(jìn)行。
收集上清/條件培養(yǎng)基：可能需要使用無血清培養(yǎng)基。
凍存細(xì)胞：需要使用專門的凍存培養(yǎng)基（通常含高濃度血清和DMSO）。
總結(jié)選擇步驟：
明確你的細(xì)胞類型。
查詢ATCC/DSMZ/ECACC等數(shù)據(jù)庫或相關(guān)文獻(xiàn)推薦的培養(yǎng)基、血清濃度及關(guān)鍵添加劑。
根據(jù)實驗?zāi)康模ňS持、分化、處理等）判斷是否需要調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基或添加劑（如換無血清、去除抗生素等）。
購買高質(zhì)量、信譽(yù)好的品牌培養(yǎng)基和血清。
對新批次血清進(jìn)行必要的細(xì)胞生長測試（強(qiáng)烈推薦）。
嚴(yán)格記錄使用的培養(yǎng)基品牌、貨號、批號、血清批號、所有添加劑濃度及配制日期。這對實驗可重復(fù)性至關(guān)重要！
二、如何進(jìn)行細(xì)胞換液
換液是為了：
去除細(xì)胞代謝廢物（乳酸、氨等）。
補(bǔ)充消耗殆盡的營養(yǎng)物質(zhì)（葡萄糖、氨基酸、生長因子等）。
維持穩(wěn)定的pH值（培養(yǎng)基中的緩沖系統(tǒng)會被代謝物影響）。
去除死細(xì)胞碎片。
在特定實驗中引入或去除某些因子。
換液頻率：
取決于細(xì)胞生長速度、接種密度、培養(yǎng)基體積。通常貼壁細(xì)胞每2-3天換液一次，快速生長的細(xì)胞可能需要每天換液。
觀察是關(guān)鍵！培養(yǎng)基顏色是重要指標(biāo)：
鮮紅/橙紅色（酚紅指示劑）：pH正常（~7.4）。
黃色：變酸（pH下降），通常由于代謝廢物積累（乳酸），說明急需換液。
紫紅色：變堿（pH升高），較少見，可能由污染或過度通氣引起。
細(xì)胞密度過高時也需要更頻繁換液。
標(biāo)準(zhǔn)換液操作步驟（以貼壁細(xì)胞為例）：
準(zhǔn)備：
將新鮮完全培養(yǎng)基放入37°C水浴鍋中預(yù)熱（至少15-30分鐘，冷培養(yǎng)基會“熱休克”細(xì)胞）。避免長時間水浴增加污染風(fēng)險。
預(yù)熱PBS（用于清洗，如果實驗需要或細(xì)胞敏感）。
準(zhǔn)備好無菌移液管、廢液缸、75%酒精噴壺、記號筆。
在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行所有操作，臺面用酒精擦拭消毒。
戴上手套，并用酒精消毒手套。
取出細(xì)胞：
從CO2培養(yǎng)箱中小心取出培養(yǎng)瓶/皿/板，避免劇烈晃動。
在顯微鏡下快速觀察細(xì)胞狀態(tài)（形態(tài)、密度、污染跡象）。
移除舊培養(yǎng)基：
輕柔操作！避免吸頭觸碰到細(xì)胞層，尤其是貼壁不牢的細(xì)胞。
打開培養(yǎng)器皿蓋子（在酒精燈火焰旁操作以減少污染風(fēng)險）。
用無菌移液管（或真空泵連接無菌吸管）小心地從培養(yǎng)器皿的一角（貼壁細(xì)胞）或邊緣（懸浮細(xì)胞離心后）吸出舊培養(yǎng)基，棄入廢液缸。
關(guān)鍵：不要直接傾倒！容易導(dǎo)致細(xì)胞脫落或污染。
（可選）清洗細(xì)胞：
對于代謝廢物多、需要精確去除血清/藥物、或細(xì)胞敏感的情況：
向培養(yǎng)器皿中加入少量預(yù)熱的無菌PBS（足以覆蓋細(xì)胞層即可）。
輕輕搖晃，洗滌細(xì)胞表面。
完全吸棄 PBS。可重復(fù)一次。
注意：頻繁清洗或PBS殘留可能對某些細(xì)胞有損傷，非必需步驟可省略。
加入新培養(yǎng)基：
取預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)器皿壁緩慢加入，避免直接沖擊細(xì)胞層。
加入適量體積（通常與原體積相同，或根據(jù)實驗需求調(diào)整）。培養(yǎng)瓶要保證能形成足夠的氣液接觸面。
放回培養(yǎng)箱：
蓋緊蓋子（培養(yǎng)瓶需擰松約1/4圈以保證氣體交換）。
做好標(biāo)記（換液日期、操作者）。
平穩(wěn)放回37°C, 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中。
針對懸浮細(xì)胞的換液：
將細(xì)胞懸液連同舊培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。
在室溫或4°C下進(jìn)行低速離心（根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整，通常200-400g，5分鐘）。目的是沉淀細(xì)胞，避免過度離心損傷細(xì)胞。
小心吸棄上清（舊培養(yǎng)基），避免吸到細(xì)胞沉淀。
用少量預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基或PBS（如果需要清洗）輕柔重懸細(xì)胞沉淀。
再次離心（如果需要清洗）。
吸棄上清（或清洗液）。
用適量預(yù)熱的新鮮完全培養(yǎng)基輕柔重懸細(xì)胞。
將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移回原培養(yǎng)器皿或新的培養(yǎng)器皿中（如果傳代或擴(kuò)增）。
放回培養(yǎng)箱。
關(guān)鍵注意事項：
無菌！無菌！無菌！這是細(xì)胞培養(yǎng)的生命線。所有操作在超凈臺進(jìn)行，物品表面和手部用酒精消毒，正確使用火焰，避免在開放區(qū)域長時間暴露。
輕柔操作：避免劇烈搖晃、吹打、移液沖擊細(xì)胞，尤其是貼壁細(xì)胞和原代細(xì)胞。
溫度：培養(yǎng)基和PBS必須預(yù)熱到37°C。冷熱應(yīng)激會嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞。
避免過度換液/清洗：不必要的操作增加污染風(fēng)險和細(xì)胞應(yīng)激。
觀察記錄：每次換液前后觀察細(xì)胞形態(tài)和密度，記錄任何異常（顆粒、渾濁、pH異常、細(xì)胞形態(tài)改變）。
血清批次一致性：不同批次血清差異大，盡量使用同一批次，更換批次前務(wù)必測試。
培養(yǎng)基有效期：注意基礎(chǔ)培養(yǎng)基、谷氨酰胺、添加物等的有效期。配制好的完全培養(yǎng)基通常在2-4周內(nèi)使用（4°C避光保存），谷氨酰胺最好現(xiàn)加現(xiàn)用或使用GlutaMAX。
常見錯誤：
使用未預(yù)熱的培養(yǎng)基/PBS。
移液時吸頭碰到細(xì)胞層導(dǎo)致細(xì)胞脫落。
直接傾倒舊培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞損失或污染。
換液頻率不當(dāng)（太頻繁浪費且應(yīng)激，太少細(xì)胞狀態(tài)差）。
忽略細(xì)胞庫/文獻(xiàn)推薦的培養(yǎng)基配方。
未測試新批次血清。
無菌操作不規(guī)范。
結(jié)論：
選擇合適的培養(yǎng)基是細(xì)胞實驗的基石，需要根據(jù)細(xì)胞類型和實驗?zāi)康淖屑?xì)查詢和驗證。換液是常規(guī)但至關(guān)重要的操作，必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌和輕柔的原則，并注意溫度控制和觀察記錄。熟練掌握這兩項技能是獲得可靠、可重復(fù)的細(xì)胞實驗結(jié)果的基本保障。
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