細(xì)胞培養(yǎng)過程中及時發(fā)現(xiàn)和處理污染問題的具體方法有哪些？
小楊 / 2025-08-16 09:29:54
百歐博偉生物：在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，及時發(fā)現(xiàn)和處理污染是維持細(xì)胞活性、保證實(shí)驗(yàn)可靠性的關(guān)鍵。污染早期往往有隱蔽跡象，需結(jié)合肉眼觀察、顯微鏡檢查、輔助檢測等手段快速識別，并根據(jù)污染類型和程度采取針對性措施。以下是具體方法：
一、污染的早期發(fā)現(xiàn)：多維度監(jiān)測
1、肉眼觀察：直觀判斷培養(yǎng)基變化
細(xì)菌污染：培養(yǎng)基通常在污染后 24-48 小時內(nèi)變渾濁（呈云霧狀、乳白或黃色），pH 值快速下降（培養(yǎng)基顏色從紅色 / 粉色變?yōu)辄S色），尤其原代細(xì)胞或高密度培養(yǎng)時更明顯。
真菌污染：初期可能在培養(yǎng)基表面或瓶壁出現(xiàn)白色、黃色或黑色的絮狀 / 絨毛狀菌落，后期擴(kuò)散后培養(yǎng)基可能渾濁，pH 值變化較慢（可能偏堿變紫）。
支原體污染：肉眼無明顯變化，培養(yǎng)基清澈，pH 值基本穩(wěn)定，需通過其他方法檢測。
交叉污染（其他細(xì)胞）：鏡下出現(xiàn)與目標(biāo)細(xì)胞形態(tài)、大小差異顯著的細(xì)胞（如上皮細(xì)胞中混入成纖維細(xì)胞樣梭形細(xì)胞），且異常細(xì)胞增殖迅速。
2、顯微鏡檢查：識別污染特征
細(xì)菌污染：高倍鏡（400×）下可見大量快速移動的小點(diǎn)狀、桿狀或球狀顆粒，分布于細(xì)胞間隙或培養(yǎng)基中，嚴(yán)重時覆蓋細(xì)胞表面，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、脫落。
真菌污染：低倍鏡（100×）下可見樹枝狀菌絲或圓形孢子，菌絲可能纏繞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)異常（如變圓、死亡）。
支原體污染：需用 400× 以上高倍鏡或熒光染色（如
Hoechst 染色，支原體 DNA 呈亮藍(lán)色小點(diǎn)附著于細(xì)胞表面或核周圍），細(xì)胞可能出現(xiàn)生長緩慢、形態(tài)變圓、空泡增多等非特異性變化。
病毒污染：通常無明顯形態(tài)變化，需通過病毒檢測試劑盒或細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE，如細(xì)胞融合、多核體）判斷。
3、輔助檢測：精準(zhǔn)確認(rèn)污染類型
支原體檢測：常用 PCR 法（特異性引物擴(kuò)增支原體基因）、熒光染色法或支原體培養(yǎng)法（需專業(yè)培養(yǎng)基），建議每 1-2 周對培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)篩查。
細(xì)菌 / 真菌鑒定：取少量污染培養(yǎng)基接種至血平板（細(xì)菌）或沙氏培養(yǎng)基（真菌），37℃培養(yǎng) 24-48 小時，觀察菌落形態(tài)并結(jié)合生化試驗(yàn)鑒定種類（如
葡萄球菌、
念珠菌等）。
交叉污染檢測：通過 STR 基因分型（人類細(xì)胞）或物種特異性 PCR（動物細(xì)胞，如小鼠、大鼠）確認(rèn)細(xì)胞來源是否純凈。
二、污染的處理：分級應(yīng)對策略
1、輕微污染（早期，污染范圍＜10%）
適用場景：剛發(fā)現(xiàn)少量細(xì)菌 / 真菌，細(xì)胞仍大部分存活且形態(tài)基本正常（多見于原代細(xì)胞或珍貴細(xì)胞系）。
處理方法：
立即更換培養(yǎng)基，加入高濃度抗生素（比常規(guī)高 5-10 倍）：細(xì)菌污染用青霉素 + 鏈霉素（終濃度 500-1000 U/mL），真菌污染用兩性霉素 B（終濃度 2.5-5 μg/mL）或制霉菌素，連續(xù)處理 2-3 天，每天換液。
處理后鏡檢：若污染消失，逐步降低抗生素濃度至常規(guī)水平；若污染未控制，立即終止（避免擴(kuò)散）。
2、嚴(yán)重污染（污染范圍＞30%）
適用場景：培養(yǎng)基嚴(yán)重渾濁，大量污染物覆蓋細(xì)胞，細(xì)胞出現(xiàn)明顯死亡或形態(tài)崩潰。
處理原則：果斷丟棄，徹底消毒，避免污染擴(kuò)散至其他細(xì)胞或環(huán)境。
具體步驟：
用 75% 酒精徹底擦拭污染培養(yǎng)瓶 / 皿的外壁，密封后放入生物安全袋，按醫(yī)療廢物處理（不可隨意傾倒廢液）。
立即用 75% 酒精擦拭超凈工作臺、移液器及培養(yǎng)箱，污染嚴(yán)重時可用含氯消毒液擦拭培養(yǎng)箱內(nèi)部，或用紫外燈照射 30 分鐘以上。
排查同批次培養(yǎng)的其他細(xì)胞：若發(fā)現(xiàn)多個樣本污染，需同步處理，并檢測試劑（如培養(yǎng)基、血清）是否存在污染。
3、支原體污染
支原體難以通過常規(guī)抗生素清除，且會持續(xù)影響細(xì)胞代謝和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建議直接丟棄污染細(xì)胞（尤其是非珍貴細(xì)胞系）。
若為珍貴細(xì)胞，可嘗試專用支原體清除試劑，按說明書連續(xù)處理 1-2 周，期間定期檢測支原體是否清除，確認(rèn)陰性后再傳代培養(yǎng)（但成功率較低，且可能影響細(xì)胞活性）。
4、交叉污染
一旦確認(rèn)交叉污染（如混入其他細(xì)胞），該細(xì)胞系已失去實(shí)驗(yàn)價(jià)值，需徹底丟棄，并追溯污染源（如操作時樣本混淆、共用試劑），加強(qiáng)樣本標(biāo)記和分區(qū)操作。
三、污染后的預(yù)防措施
1、全面排查污染源：
檢測同批次使用的培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑（取少量無菌培養(yǎng)，觀察是否渾濁），若試劑污染需整批丟棄。
檢查培養(yǎng)箱、超凈工作臺是否存在衛(wèi)生死角（如培養(yǎng)箱水盤滋生霉菌），定期清潔消毒（每周 1 次）。
2、強(qiáng)化操作規(guī)范：
操作人員重新培訓(xùn)無菌操作流程，避免在超凈臺內(nèi)同時處理多個樣本，接觸不同細(xì)胞后及時更換手套和消毒臺面。
珍貴細(xì)胞系建議低溫凍存?zhèn)浞?，一旦污染可?fù)蘇備用細(xì)胞，減少實(shí)驗(yàn)損失。
3、定期環(huán)境監(jiān)測：
每月對培養(yǎng)環(huán)境（超凈臺、培養(yǎng)箱）進(jìn)行沉降菌檢測（暴露平板培養(yǎng) 48 小時，觀察菌落數(shù)），確保無菌環(huán)境達(dá)標(biāo)。
四、總結(jié)
污染處理的核心原則是：“早發(fā)現(xiàn)、早處理、嚴(yán)防控”。輕微污染可嘗試挽救，但需權(quán)衡細(xì)胞活性和實(shí)驗(yàn)可靠性；嚴(yán)重污染或支原體 / 交叉污染則應(yīng)果斷丟棄，避免污染擴(kuò)散。日常培養(yǎng)中，建議每日鏡檢細(xì)胞狀態(tài)，定期篩查支原體，同時嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，從源頭降低污染風(fēng)險(xiǎn)。
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