微生物實(shí)驗(yàn)中選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則、方法及制備過程！
小楊 / 2025-08-19 09:51:52
培養(yǎng)基是人工配制的、供微生物、植物組織或動(dòng)物細(xì)胞生長繁殖及代謝研究的營養(yǎng)基質(zhì)，其選用與設(shè)計(jì)直接影響培養(yǎng)效果。以下從原則、方法及制備過程三方面詳細(xì)說明：
一、選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的原則
設(shè)計(jì)或選用培養(yǎng)基需圍繞培養(yǎng)對象的需求、培養(yǎng)目的及實(shí)際應(yīng)用場景，核心原則包括：
1、目的明確，適配培養(yǎng)對象
不同生物的營養(yǎng)需求差異顯著，需針對性設(shè)計(jì)：
微生物：細(xì)菌（需碳源、氮源、無機(jī)鹽，多數(shù)需中性 pH）、真菌（偏酸性 pH，可利用復(fù)雜碳源如淀粉）、放線菌（需高碳氮比，如淀粉為碳源）；
植物細(xì)胞：需無機(jī)鹽（如 MS 培養(yǎng)基的大量元素和微量元素）、蔗糖、植物激素（生長素、細(xì)胞分裂素）；
動(dòng)物細(xì)胞：需血清（提供生長因子）、葡萄糖、氨基酸，且滲透壓需與細(xì)胞內(nèi)液接近。
2、營養(yǎng)成分協(xié)調(diào)，比例適宜
核心營養(yǎng)物質(zhì)（碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子）需齊全，且比例合理：
碳氮比（C/N）：細(xì)菌繁殖期需 C/N=5:1，產(chǎn)芽孢時(shí)需 C/N=20:1；真菌需更高 C/N（如查氏培養(yǎng)基 C/N≈10:1）。
無機(jī)鹽濃度：避免過高導(dǎo)致滲透壓失衡（如 NaCl 濃度過高抑制多數(shù)微生物），或過低影響酶活性（如 Mg²?是多種酶的輔酶）。
生長因子：對營養(yǎng)缺陷型生物（如乳酸菌需維生素 B?），需精準(zhǔn)添加特定物質(zhì)（如氨基酸、堿基）。
3、理化條件適宜
pH 值：需符合培養(yǎng)對象的耐受范圍（細(xì)菌 6.5-7.5，真菌 5.0-6.0，動(dòng)物細(xì)胞 7.2-7.4），可通過緩沖對（如磷酸二氫鉀 / 磷酸氫二鉀）穩(wěn)定。
滲透壓：與細(xì)胞內(nèi)液相當(dāng)（如動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基滲透壓約 280-320 mOsm/kg），避免細(xì)胞因滲透作用破裂或皺縮。
氧化還原電位：厭氧菌需低氧化還原電位（可加入巰基乙醇還原），好氧菌需充足氧氣（培養(yǎng)基裝量不宜過多）。
4、經(jīng)濟(jì)節(jié)約與可行性
大規(guī)模培養(yǎng)（如工業(yè)發(fā)酵）需優(yōu)先選用廉價(jià)原料：如用玉米粉代替葡萄糖（碳源）、豆餅粉代替蛋白胨（氮源），降低成本。
原料穩(wěn)定性：避免使用易變質(zhì)或難儲(chǔ)存的成分（如新鮮血清需低溫保存，可替換為合成血清替代物）。
5、無菌與安全
制備過程需徹底滅菌，避免雜菌污染；
培養(yǎng)食用 / 藥用生物（如益生菌、疫苗生產(chǎn)用細(xì)胞）時(shí)，原料需無毒無害（如禁用工業(yè)級(jí)化學(xué)品，選用食品級(jí)或醫(yī)藥級(jí)）。
二、選用和設(shè)計(jì)培養(yǎng)基的方法
培養(yǎng)基設(shè)計(jì)需結(jié)合理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，具體步驟如下：
1、明確核心需求
確定培養(yǎng)對象（如
大腸桿菌、煙草愈傷組織）和培養(yǎng)目的（如擴(kuò)增、代謝產(chǎn)物積累、分離篩選）；
例：若需分離土壤中的固氮菌，因固氮菌可利用空氣中的 N?，培養(yǎng)基需不含氮源（選擇性篩選）。
2、文獻(xiàn)調(diào)研與營養(yǎng)需求分析
查閱該生物的已知營養(yǎng)特性：如是否為自養(yǎng)型（可利用 CO?為碳源）或異養(yǎng)型（需有機(jī)碳源）；是否有營養(yǎng)缺陷（如某種氨基酸不能合成）。
參考同類培養(yǎng)基配方：如培養(yǎng)細(xì)菌先參考牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌參考馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）。
3、配方設(shè)計(jì)與成分篩選
確定基礎(chǔ)成分：
碳源：葡萄糖（速效）、淀粉（緩效）、甘油（適用于某些細(xì)菌）；
氮源：蛋白胨（有機(jī)氮）、硝酸銨（無機(jī)氮，適用于植物細(xì)胞）；
無機(jī)鹽：提供 K?、Na?、Ca²?、Mg²?等；
生長因子：維生素（如 B 族）、氨基酸。
優(yōu)化成分濃度：通過單因素試驗(yàn)（固定其他成分，調(diào)整某一成分濃度）或正交試驗(yàn)，確定各成分的最適濃度（如通過 OD 值、菌落直徑判斷生長狀態(tài)）。
4、驗(yàn)證與調(diào)整
小規(guī)模試驗(yàn)：用設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)生物，觀察生長速度、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量等指標(biāo)；
排除干擾因素：如成分間的拮抗作用（如 Ca²?與 PO?³?易沉淀，需分別溶解后混合）；
最終確定配方：兼顧效果與成本，形成可重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)化配方。
三、培養(yǎng)基的制備過程
培養(yǎng)基制備需嚴(yán)格遵循步驟，確保無菌性和穩(wěn)定性，核心流程如下：
1、計(jì)算與稱量
根據(jù)配方計(jì)算各成分的用量（如 1L 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基需牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、NaCl 5g）；
稱量時(shí)使用分析天平（精密配方）或托盤天平（常規(guī)配方），避免誤差過大。
2、溶解與混合
將稱量好的成分加入適量蒸餾水（或去離子水）中，攪拌溶解；
特殊成分處理：
瓊脂（固體培養(yǎng)基）：需加熱煮沸至完全溶解（避免結(jié)塊）；
難溶成分（如碳酸鈣）：單獨(dú)研磨后再溶解；
不穩(wěn)定成分（如維生素）：暫不加入，待滅菌后單獨(dú)處理。
3、調(diào)節(jié) pH
用 pH 計(jì)或精密 pH 試紙檢測，通過 1mol/L HCl 或 NaOH 溶液調(diào)整至目標(biāo) pH（如細(xì)菌培養(yǎng)基調(diào)至 7.0）；
注意：高溫滅菌后 pH 會(huì)略有變化（通常下降 0.2-0.5），需提前預(yù)留緩沖空間。
4、過濾（可選）
對澄清度要求高的培養(yǎng)基（如動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基），用濾紙或 0.22μm 濾膜過濾，去除雜質(zhì)或未溶解的顆粒。
5、分裝
根據(jù)培養(yǎng)需求分裝到容器（試管、三角瓶、培養(yǎng)皿），注意裝量（如三角瓶裝量不超過容積的 1/2，避免滅菌時(shí)溢出）；
試管需加棉塞或硅膠塞（透氣且防雜菌），三角瓶用紗布或透氣蓋密封。
6、滅菌
高壓蒸汽滅菌：適用于大多數(shù)培養(yǎng)基（121℃、103kPa、15-30 分鐘），可殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物；
例外：含糖培養(yǎng)基需降低溫度（115℃、30 分鐘），避免糖分焦化；
過濾除菌：適用于不耐熱成分（如血清、抗生素、維生素），用 0.22μm 濾膜過濾后，在培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃時(shí)加入（避免高溫破壞）。
7、滅菌后處理與保存
固體培養(yǎng)基：滅菌后趁熱倒平板（每皿約 15-20mL），冷卻后倒置保存（防止冷凝水污染）；
液體培養(yǎng)基：冷卻后 4℃保存，避免陽光直射；
無菌檢查：隨機(jī)取少量培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，無雜菌生長即為合格。
四、總結(jié)
培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)需兼顧“營養(yǎng)適配性”“理化適宜性”和“實(shí)際可行性”，制備過程則需嚴(yán)格控制無菌性和成分穩(wěn)定性。合理的培養(yǎng)基是微生物培養(yǎng)、細(xì)胞工程、發(fā)酵工業(yè)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)，直接影響實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)的效率與結(jié)果。
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