冷凍干燥保藏技術(shù)對微生物菌種篩選的核心標(biāo)準(zhǔn)是什么？
小楊 / 2025-09-28 10:39:25
百歐博偉生物：冷凍干燥保藏技術(shù)對微生物菌種的篩選核心標(biāo)準(zhǔn)是確保菌種在凍干過程（凍結(jié)、脫水）及長期儲存后能高存活率復(fù)蘇，且遺傳性狀穩(wěn)定，具體可從菌種自身特性、培養(yǎng)狀態(tài)、耐受性三個維度篩選。
一、核心篩選標(biāo)準(zhǔn)：以“高復(fù)蘇率”為核心
1、菌種生長階段篩選：優(yōu)先選擇“對數(shù)生長期”菌種
這是最關(guān)鍵的篩選條件，直接決定凍干后存活率。
原理：對數(shù)生長期的微生物細(xì)胞代謝旺盛、細(xì)胞壁 / 膜結(jié)構(gòu)完整、抗逆性（抗低溫、抗脫水）最強(qiáng)，能更好耐受凍干過程中的冰晶損傷和脫水脅迫。
篩選方法：通過“濁度法”（細(xì)菌）或“孢子計數(shù)法”（真菌）判斷生長階段——
細(xì)菌：當(dāng)液體培養(yǎng)基 OD600 值達(dá)到 0.6-0.8（不同菌種有差異，如
大腸桿菌 OD600≈0.7 時為對數(shù)中期），且鏡檢無衰老細(xì)胞（無腫脹、破裂形態(tài)）。
真菌 / 放線菌：選擇孢子成熟但未脫落的階段（如霉菌培養(yǎng) 7-10 天，孢子囊飽滿；放線菌培養(yǎng) 14 天左右，孢子絲未斷裂），避免使用菌絲體（菌絲體脫水后易斷裂，存活率低）。
排除項：絕對不能選擇“衰亡期”菌種（細(xì)胞大量裂解、代謝產(chǎn)物積累，凍干后存活率通常低于 10%）。
2、菌種耐受性篩選：優(yōu)先選擇“抗逆性強(qiáng)”的菌種
凍干過程包含“低溫凍結(jié)”和“真空脫水”兩步，需篩選能耐受這兩種脅迫的菌種。
抗低溫性篩選：
提前進(jìn)行預(yù)試驗(yàn) —— 將候選菌種在 - 20℃冷凍 24 小時，解凍后接種培養(yǎng)，選擇復(fù)蘇率≥50% 的菌種。若菌種對低溫敏感（如部分嗜熱菌，50℃以上才生長），凍干后幾乎無法復(fù)蘇，需排除。
抗脫水性篩選：
用“蔗糖脫水法”測試 —— 將菌懸液與 10% 蔗糖溶液混合，室溫放置 4 小時（模擬輕度脫水），再接種培養(yǎng)，選擇存活率≥60% 的菌種?？姑撍圆畹木N（如某些無芽孢細(xì)菌），凍干后細(xì)胞易因脫水導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，需謹(jǐn)慎使用（需搭配更優(yōu)保護(hù)劑）。
特殊結(jié)構(gòu)優(yōu)先：
優(yōu)先選擇有“休眠結(jié)構(gòu)”的菌種，如：
真菌：產(chǎn)孢子的菌種（如
青霉菌、
曲霉菌），孢子比菌絲體更耐逆，是凍干保藏的首選形態(tài)。
排除項：無休眠結(jié)構(gòu)的脆弱菌種（如
支原體），除非有專用保護(hù)劑（如含血清的復(fù)合保護(hù)劑），否則不建議用凍干保藏。
3、菌種純度與穩(wěn)定性篩選：確保“無雜菌、無變異”
凍干后菌種需長期保存，若初始菌種不純或遺傳不穩(wěn)定，會導(dǎo)致后續(xù)使用時出現(xiàn)污染或性狀改變。
純度篩選：
凍干前必須通過“平板劃線法”或“涂布法”純化菌種，鏡檢（革蘭氏染色、芽孢染色等）確認(rèn)無雜菌（如細(xì)菌中無真菌、霉菌中無細(xì)菌），必要時進(jìn)行生化鑒定或分子鑒定（16S rRNA 測序），確保菌種單一。
遺傳穩(wěn)定性篩選：
對需保留特定性狀的菌種（如產(chǎn)酶菌、致病菌），需提前進(jìn)行穩(wěn)定性測試 —— 將菌種連續(xù)傳代 5-10 次，每次傳代后檢測目標(biāo)性狀（如酶活、毒力），選擇性狀無明顯下降（變化幅度≤10%）的菌種。若菌種易變異（如某些病毒、噬菌體），凍干后可能因基因損傷導(dǎo)致性狀丟失，需排除或采用更嚴(yán)格的保藏條件（如 - 80℃?zhèn)浞荩?/div>
二、不同類型微生物的針對性篩選細(xì)則
不同微生物的結(jié)構(gòu)和抗逆性差異大，需結(jié)合類別制定篩選標(biāo)準(zhǔn)，具體如下表：
微生物類別 優(yōu)先篩選的菌種特征 篩選排除項 凍干存活率目標(biāo)
細(xì)菌（有芽孢） 產(chǎn)芽孢、芽孢成熟度高（鏡檢芽孢呈圓形/橢圓形，無染色）、對數(shù)后期菌種 芽孢未成熟（染色后呈紅色，未形成厚壁）、污染雜菌 ≥80%
細(xì)菌（無芽孢） 抗逆性強(qiáng)（如乳酸菌需耐酸性 + 耐低溫）、對數(shù)中期菌種、無溶血等脆弱特性 嗜熱菌（最適溫度≥45℃）、支原體等無細(xì)胞壁菌種 ≥50%
酵母菌 產(chǎn)子囊孢子的菌種（如釀酒酵母）、對數(shù)后期至穩(wěn)定期初期（細(xì)胞飽滿） 營養(yǎng)細(xì)胞脆弱的酵母菌（如某些假絲酵母菌）、污染霉菌 ≥60%
真菌/放線菌 孢子量大、孢子成熟（如放線菌孢子絲斷裂，孢子呈鏈狀）、無色素過度分泌 僅含菌絲體（無孢子）、菌絲易斷裂的真菌（如某些擔(dān)子菌） ≥70%
病毒/噬菌體 有包膜或衣殼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的病毒、滴度高（≥10^9 PFU/mL） 無包膜的脆弱病毒、滴度低（<10^7 PFU/mL） ≥40%
三、篩選后的預(yù)試驗(yàn)驗(yàn)證（必做步驟）
即使符合上述標(biāo)準(zhǔn)，仍需通過“小批量凍干預(yù)試驗(yàn)”最終確認(rèn)菌種是否適合凍干，步驟如下：
取候選菌種，按凍干流程制備菌懸液（搭配適配保護(hù)劑），分裝 3-5 支凍干管。
完成凍干后，隨機(jī)取 2 支復(fù)蘇，計算存活率（復(fù)蘇菌落數(shù) / 凍干前菌落數(shù) ×100%）。
若存活率≥50%，且復(fù)蘇后菌種性狀穩(wěn)定（如菌落形態(tài)、生化特性無變化），則判定為“適合凍干保藏”；若存活率 < 30%，需重新篩選菌種或優(yōu)化保護(hù)劑配方（如增加脫脂乳濃度、添加谷氨酸鈉）。
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