微生物學實驗的核心技術：接種、分離和培養(yǎng)及無菌操作！
小楊 / 2025-10-11 10:52:12
百歐博偉生物：微生物的接種、分離、培養(yǎng)及無菌操作是微生物學實驗的核心技術，貫穿于菌種篩選、鑒定、發(fā)酵生產(chǎn)等多個領域。其核心目標是在無雜菌污染的環(huán)境中，實現(xiàn)目標微生物的純培養(yǎng)與高效增殖，為后續(xù)研究或應用奠定基礎。以下將從四個關鍵環(huán)節(jié)展開，詳細解析原理、操作步驟及注意事項。
一、無菌操作：微生物實驗的“生命線”
無菌操作是所有環(huán)節(jié)的前提，目的是防止環(huán)境中的雜菌（如空氣中的細菌、真菌孢子）污染培養(yǎng)基或目標菌種，同時避免目標微生物擴散到環(huán)境中。其核心邏輯是“隔離污染源”，具體包括環(huán)境無菌、器具無菌和操作無菌三部分。
1、核心原理
通過物理（如高溫、過濾）或化學（如消毒）手段，殺滅或去除操作環(huán)境、器具表面及空氣中的微生物，建立局部“無菌區(qū)”，確保目標微生物在專屬空間內(nèi)生長。
2、關鍵操作與注意事項
操作環(huán)節(jié) 具體方法 注意事項
環(huán)境無菌 超凈工作臺：開啟紫外燈消毒 30min，后開風機形成無菌氣流；無菌室：定期用甲醛熏蒸或含氯消毒劑擦拭地面、墻面。 紫外燈消毒時人員需撤離（對人體皮膚、眼睛有害）；超凈工作臺內(nèi)禁止放置無關物品，操作前用 75% 酒精擦拭臺面。
器具無菌 玻璃器皿（培養(yǎng)皿、試管、移液管）：121℃高壓蒸汽滅菌；接種工具（接種環(huán)、涂布棒）：酒精燈外焰灼燒滅菌（外焰溫度達 500-600℃，可瞬間殺滅微生物）；培養(yǎng)基：同玻璃器皿，需根據(jù)成分調整滅菌時間。 滅菌后器具需密封保存，避免二次污染；接種環(huán)灼燒后需冷卻至室溫（可在空白培養(yǎng)基邊緣觸碰，無氣泡即冷卻），避免燙死目標菌種。
操作無菌 人員：操作前洗手，戴無菌手套，穿實驗服，袖口扎緊；動作：所有操作在超凈工作臺或酒精燈火焰周圍 10cm 內(nèi)進行，試管口、培養(yǎng)皿蓋需傾斜打開，避免直接暴露于空氣；避免交叉污染：不同菌種的器具分開使用，操作后及時消毒臺面。 禁止在操作時說話、咳嗽；培養(yǎng)皿開蓋后，皿蓋朝下放置（避免蓋上的冷凝水滴落污染培養(yǎng)基）。
二、培養(yǎng)基制備：微生物的“營養(yǎng)基地”
培養(yǎng)基是為微生物提供生長所需碳源、氮源、無機鹽、維生素及水的營養(yǎng)基質，需根據(jù)目標微生物的營養(yǎng)需求定制（如細菌常用 LB 培養(yǎng)基，真菌常用 PDA 培養(yǎng)基）。
1、常見培養(yǎng)基類型
類型 特點 用途示例
基礎培養(yǎng)基 營養(yǎng)成分全面，適合多數(shù)微生物生長 LB 培養(yǎng)基（培養(yǎng)大腸桿菌）
選擇培養(yǎng)基 加入抑制劑，抑制雜菌 麥康凱培養(yǎng)基（抑制革蘭氏陽性菌，篩選大腸桿菌）
鑒別培養(yǎng)基 加入指示劑，區(qū)分不同微生物 伊紅美藍培養(yǎng)基（大腸桿菌菌落呈紫黑色，有金屬光澤）
固體培養(yǎng)基 加入 1.5%-2% 瓊脂（凝固劑），呈固態(tài) 分離單菌落、菌種保存
液體培養(yǎng)基 無瓊脂，呈液態(tài) 大規(guī)模培養(yǎng)（如發(fā)酵生產(chǎn)）
2、制備步驟
稱量：按配方準確稱取各成分（如 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g）；
溶解：將成分加入去離子水中，加熱攪拌至完全溶解，定容至所需體積；
調 pH：用 NaOH 或 HCl 調節(jié) pH（細菌通常為 7.0-7.2，真菌為 5.5-6.0），用 pH 試紙或 pH 計檢測；
滅菌：分裝至試管或三角瓶，加棉塞或硅膠塞，121℃高壓蒸汽滅菌 20-30min；
倒平板（固體培養(yǎng)基）：滅菌后待培養(yǎng)基冷卻至 50-60℃（手觸容器外壁不燙），在超凈工作臺內(nèi)倒入無菌培養(yǎng)皿（每皿約 15-20mL），平放冷卻凝固后備用。
三、微生物接種：將目標菌種“轉移”到培養(yǎng)基
接種是將少量目標微生物（菌液、菌苔或孢子）轉移到新鮮培養(yǎng)基上的操作，需根據(jù)培養(yǎng)目的選擇不同方法。
1、常用接種方法及操作
接種方法 工具 操作步驟 適用場景
劃線接種 接種環(huán) 1.接種環(huán)灼燒滅菌，冷卻后蘸取少量菌液/菌苔；2.左手持培養(yǎng)皿，右手持接種環(huán)，在培養(yǎng)基表面 “分區(qū)劃線”；3.劃線后灼燒接種環(huán)，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。 固體培養(yǎng)基分離單菌落（劃線后菌落隨分區(qū)逐漸稀疏，最終得到單個菌落）
涂布接種 無菌移液管、涂布棒 1.用移液管吸取 0.1-0.2mL 菌液，滴加到固體培養(yǎng)基表面；2.涂布棒灼燒滅菌，冷卻后將菌液均勻涂抹在培養(yǎng)基表面；3.靜置 5-10min（讓菌液吸收），倒置培養(yǎng)。 計數(shù)（如菌落形成單位 CFU 計數(shù)）、篩選單菌落
穿刺接種 接種針 1.接種針灼燒滅菌，冷卻后蘸取少量菌苔；2.左手持裝有半固體培養(yǎng)基的試管，右手持接種針，垂直刺入培養(yǎng)基中心，然后沿原路徑拔出；3.試管直立培養(yǎng)。 觀察微生物的運動能力、保存菌種
液體接種 接種環(huán)/移液管 1.接種環(huán)蘸取菌苔，或移液管吸取菌液，伸入液體培養(yǎng)基試管中；2.接種環(huán)在液體中輕輕攪拌（或直接滴加菌液），避免觸碰試管壁；3.試管直立培養(yǎng)（可振蕩培養(yǎng)，增加溶氧量）。 大規(guī)模培養(yǎng)微生物（如獲取大量菌液）
2、核心注意事項
接種工具必須徹底滅菌，且冷卻后使用，避免損傷菌種；
接種過程中，試管口、培養(yǎng)皿蓋始終保持“半開”狀態(tài)，減少空氣暴露時間；
劃線接種時，線條需平行且不重疊，分區(qū)清晰，確保最終能得到單菌落。
四、微生物分離與培養(yǎng)：從“混合菌群”到“純培養(yǎng)”
分離的目的是從自然樣品（如土壤、水體、食品）中，將目標微生物從混合菌群中篩選出來，獲得純培養(yǎng)物（單一菌種的培養(yǎng)物）；培養(yǎng)則是為分離后的微生物提供適宜環(huán)境，使其增殖。
1、微生物分離：核心是“篩選與純化”
（1）分離思路
根據(jù)目標微生物的生理特性（如營養(yǎng)需求、耐溫性、耐藥性）或生態(tài)特性（如好氧/厭氧），設計選擇性條件，抑制雜菌生長，富集目標微生物。
（2）經(jīng)典分離方法：稀釋涂布平板法
適用于從含菌量高的樣品（如土壤）中分離單菌落，步驟如下：
樣品稀釋：取 10g 土壤樣品，加入 90mL 無菌生理鹽水，振蕩均勻（為 10?¹ 稀釋液）；吸取 1mL 10?¹ 稀釋液，加入 9mL 無菌生理鹽水，得到 10?² 稀釋液，依次稀釋至 10??或 10??（根據(jù)樣品含菌量調整）；
涂布接種：分別吸取 10??、10??、10??稀釋液各 0.1mL，滴加到選擇培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹；
培養(yǎng)：將平板倒置（避免冷凝水滴落污染菌落），放入適宜溫度的培養(yǎng)箱（如細菌 37℃，真菌 28℃），培養(yǎng) 1-3 天；
純化單菌落：觀察平板上的菌落形態(tài)（大小、顏色、邊緣、透明度），挑取形態(tài)特征一致的單菌落，用劃線接種法接種到新鮮基礎培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后得到純培養(yǎng)物。
（3）其他分離方法
富集培養(yǎng)法：用液體選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)樣品，目標微生物大量增殖后，再涂布分離（如用高糖培養(yǎng)基富集酵母菌）；
厭氧分離法：用厭氧培養(yǎng)箱或厭氧袋（加入?yún)捬醍a(chǎn)氣包），分離厭氧微生物（如
破傷風桿菌）。
2、微生物培養(yǎng)：控制“環(huán)境條件”
微生物的生長受溫度、氧氣、pH、濕度等因素影響，需根據(jù)菌種特性調控培養(yǎng)條件：
溫度：
嗜冷菌（0-20℃）：如海洋中的某些細菌；
嗜溫菌（20-45℃）：多數(shù)致病菌和工業(yè)菌種（如
大腸桿菌 37℃，青霉素生產(chǎn)菌 25-28℃）；
嗜熱菌（45-70℃）：如溫泉中的芽孢桿菌。
氧氣：
好氧菌：需通入空氣或振蕩培養(yǎng)（如
枯草芽孢桿菌）；
厭氧菌：需隔絕氧氣（如用厭氧培養(yǎng)箱，或在培養(yǎng)基中加入還原劑如巰基乙酸鈉）；
兼性厭氧菌：有氧、無氧環(huán)境均可生長（如
大腸桿菌）。
培養(yǎng)時間：細菌通常培養(yǎng) 1-2 天，真菌培養(yǎng) 3-7 天，放線菌培養(yǎng) 5-10 天，需根據(jù)菌落生長速度調整。
五、常見問題與解決方案
培養(yǎng)基污染（出現(xiàn)雜菌菌落）：
原因：滅菌不徹底、倒平板時環(huán)境污染、操作時未遵循無菌原則；
解決：重新滅菌培養(yǎng)基，嚴格在超凈工作臺內(nèi)操作，接種前檢查器具無菌狀態(tài)。
劃線后無單菌落或菌落稀疏：
原因：菌種濃度過低、接種環(huán)冷卻不徹底（燙死菌種）、劃線時力度過大（劃破培養(yǎng)基）；
解決：增加菌種濃度，接種環(huán)冷卻后再劃線，劃線時輕觸培養(yǎng)基表面。
液體培養(yǎng)時微生物生長緩慢：
原因：溶氧量不足（好氧菌）、溫度不適、營養(yǎng)不足；
解決：振蕩培養(yǎng)（增加溶氧），調整培養(yǎng)溫度，更換營養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基。
綜上，微生物的接種、分離、培養(yǎng)及無菌操作是一個系統(tǒng)性過程，需嚴格把控每一個細節(jié) —— 從環(huán)境消毒到器具滅菌，從培養(yǎng)基配方到接種手法，任何一步的疏忽都可能導致實驗失敗。只有熟練掌握這些技術，才能準確獲取目標微生物的純培養(yǎng)物，為后續(xù)的微生物鑒定、代謝產(chǎn)物分析或工業(yè)應用提供可靠基礎。
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