固定化微生物制備方法的原理、操作特點(diǎn)及適用場(chǎng)景！
小楊 / 2025-10-13 10:20:39
百歐博偉生物：固定化微生物技術(shù)是通過物理或化學(xué)手段，將游離微生物限制在特定空間內(nèi)，使其保持活性并可重復(fù)使用的技術(shù)。其制備方法需兼顧微生物活性保留、載體結(jié)合穩(wěn)定性和傳質(zhì)效率，主要可分為物理吸附法、包埋法、共價(jià)結(jié)合法和交聯(lián)法四大類，各類方法的原理、操作特點(diǎn)及適用場(chǎng)景存在顯著差異，具體如下：
一、物理吸附法（Physical Adsorption）
1、核心原理
利用微生物細(xì)胞表面的電荷、疏水基團(tuán)等與載體表面的物理作用力（如范德華力、靜電引力、疏水作用）實(shí)現(xiàn)吸附固定，無需化學(xué)試劑，是最溫和的固定化方法之一。
2、關(guān)鍵操作步驟
載體預(yù)處理：選擇多孔或高比表面積載體（如活性炭、硅藻土），通過清洗、干燥或酸堿調(diào)節(jié)（如調(diào)節(jié) pH 至微生物等電點(diǎn)附近）增強(qiáng)吸附能力；
吸附反應(yīng)：將預(yù)處理后的載體與微生物懸浮液（濃度通常為 10?-10¹? CFU/mL）在適宜溫度（20-30℃）、pH（根據(jù)微生物最適環(huán)境，如細(xì)菌偏中性、真菌偏酸性）下混合，振蕩或攪拌 0.5-4 小時(shí)，使微生物充分吸附；
分離洗滌：通過離心或過濾去除未吸附的游離微生物，用生理鹽水或緩沖液洗滌 2-3 次，避免殘留游離菌干擾。
3、常用載體
無機(jī)載體：活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、沸石、二氧化硅；
有機(jī)載體：木屑、纖維素、樹脂（如大孔吸附樹脂）。
4、優(yōu)缺點(diǎn)及適用場(chǎng)景
操作簡單、成本低；
無化學(xué)試劑損傷，微生物活性保留率高；
載體可重復(fù)再生 吸附力弱，易受環(huán)境因素（如 pH、離子強(qiáng)度）影響導(dǎo)致微生物脫落；
載菌量較低（通常 < 10? CFU/g 載體） 需保持微生物高活性的場(chǎng)景（如食品發(fā)酵、益生菌固定）；
低濃度污染物處理（如低 COD 廢水降解）
二、包埋法（Entrapment）
1、核心原理
將微生物細(xì)胞包裹在多孔性載體（如凝膠、高分子膜）形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，利用載體的空間阻隔作用限制微生物移動(dòng)，同時(shí)允許底物、產(chǎn)物等小分子物質(zhì)自由擴(kuò)散。是目前應(yīng)用最廣泛的固定化方法。
2、主要分類及操作
根據(jù)載體形態(tài)，可分為凝膠包埋法和微膠囊包埋法：
（1）凝膠包埋法（最常用）
載體類型：天然凝膠（瓊脂、海藻酸鹽、卡拉膠）、合成凝膠（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇 PVA）；
典型操作（以海藻酸鹽為例）：
配制 2%-4% 的海藻酸鈉溶液，加熱溶解后冷卻至 30-40℃（避免燙傷微生物）；
按體積比 1:1-1:3 加入微生物懸浮液，攪拌均勻形成“菌 - 膠混合液”；
用注射器將混合液滴入 0.1-0.2 mol/L 的氯化鈣溶液中，靜置 1-2 小時(shí)，形成直徑 1-3 mm 的凝膠珠；
用生理鹽水洗滌凝膠珠，去除殘留氯化鈣。
（2）微膠囊包埋法
原理：通過乳化或界面聚合法，在微生物表面形成一層超薄高分子膜（厚度通常 1-10 μm），形成微膠囊（直徑 5-500 μm）；
典型操作（以海藻酸鈉 - 殼聚糖為例）：
先將微生物用海藻酸鈉包埋成凝膠珠；
將凝膠珠浸泡在 0.1%-0.5% 的殼聚糖溶液中（pH 5.0-6.0），靜置 30 分鐘，海藻酸鈉（負(fù)電）與殼聚糖（正電）在界面形成聚電解質(zhì)膜；
再用 0.1 mol/L 的檸檬酸鈉溶液輕微溶脹，去除內(nèi)部未交聯(lián)的海藻酸鈉，形成中空微膠囊（微生物懸浮于囊內(nèi)）。
3、優(yōu)缺點(diǎn)及適用場(chǎng)景
載菌量高（可達(dá) 10¹?-10¹¹ CFU/g 載體）；
微生物被保護(hù)，抗沖擊能力強(qiáng)；
穩(wěn)定性好，不易脫落 傳質(zhì)阻力較大（尤其凝膠網(wǎng)絡(luò)致密時(shí)，底物擴(kuò)散慢）；
天然凝膠（如瓊脂）易被微生物分解，壽命短 高濃度污染物處理（如高 COD）；
連續(xù)發(fā)酵工藝（如乙醇發(fā)酵、有機(jī)酸生產(chǎn)）；
環(huán)境波動(dòng)大的場(chǎng)景（如工業(yè)廢水處理）
三、共價(jià)結(jié)合法（Covalent Binding）
1、核心原理
利用化學(xué)試劑（交聯(lián)劑）使微生物細(xì)胞表面的活性基團(tuán)（如氨基 - NH?、羧基 - COOH、羥基 - OH）與載體表面的功能基團(tuán)（如醛基 - CHO、環(huán)氧基）形成共價(jià)鍵，結(jié)合強(qiáng)度極高。
2、關(guān)鍵操作步驟
載體活化：對(duì)載體（如纖維素、葡聚糖、多孔玻璃）進(jìn)行化學(xué)修飾，引入可反應(yīng)的功能基團(tuán)（如用戊二醛活化載體，生成醛基 - CHO）；
共價(jià)偶聯(lián)：將活化后的載體與微生物懸浮液在溫和條件（如 pH 7.0-8.0、25℃）下混合，加入交聯(lián)劑，反應(yīng) 1-3 小時(shí)，使微生物表面氨基與載體醛基形成 Schiff 堿鍵；
終止與洗滌：加入過量的乙醇胺或甘氨酸終止反應(yīng)，去除未反應(yīng)的交聯(lián)劑和游離微生物，避免殘留試劑損傷微生物。
3、常用載體與交聯(lián)劑
載體：纖維素衍生物（如羧甲基纖維素）、葡聚糖凝膠、多孔玻璃、聚苯乙烯樹脂；
交聯(lián)劑：戊二醛（最常用，雙功能試劑，可同時(shí)連接載體和微生物）、碳二亞胺（EDC）、環(huán)氧氯丙烷。
4、優(yōu)缺點(diǎn)及適用場(chǎng)景
結(jié)合強(qiáng)度極高，微生物幾乎不脫落；
穩(wěn)定性好，可長期重復(fù)使用 化學(xué)試劑可能破壞微生物細(xì)胞膜或酶活性，活性保留率低（通常 < 50%）；
操作復(fù)雜，成本高，需嚴(yán)格控制反應(yīng)條件 對(duì)穩(wěn)定性要求極高的場(chǎng)景（如連續(xù)流反應(yīng)器長期運(yùn)行）；
耐受高剪切力的環(huán)境（如攪拌式反應(yīng)器）
四、交聯(lián)法（Cross-Linking）
1、核心原理
無需載體，直接利用交聯(lián)劑使微生物細(xì)胞之間通過共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的“細(xì)胞聚集體”，實(shí)現(xiàn)固定化。
2、關(guān)鍵操作步驟
菌液制備：將微生物培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，用緩沖液重懸至高濃度（10¹?-10¹¹ CFU/mL）；
交聯(lián)反應(yīng)：在攪拌下緩慢滴加交聯(lián)劑（如戊二醛，終濃度 0.1%-1.0%），25℃反應(yīng) 0.5-2 小時(shí)，觀察到菌體形成絮狀或顆粒狀聚集體；
后處理：離心收集聚集體，用緩沖液反復(fù)洗滌，去除殘留交聯(lián)劑，必要時(shí)可將聚集體破碎成適宜大小（0.1-1 mm）。
3、常用交聯(lián)劑
戊二醛（最常用，可使細(xì)胞表面氨基交聯(lián)）；
京尼平（天然交聯(lián)劑，毒性低，適用于食品級(jí)微生物固定）；
甲醛（成本低，但毒性高，僅用于工業(yè)廢水處理）。
4、優(yōu)缺點(diǎn)及適用場(chǎng)景
無需載體，成本低；
聚集體機(jī)械強(qiáng)度高，抗剪切力強(qiáng) 交聯(lián)劑易導(dǎo)致微生物活性下降；
聚集體內(nèi)部傳質(zhì)阻力大，易出現(xiàn)“中心死亡”；
操作條件敏感（如交聯(lián)劑濃度過高會(huì)完全殺死微生物） 高剪切力的反應(yīng)器（如高速攪拌罐）；
低成本的工業(yè)廢水處理（如印染廢水、石化廢水）
五、制備過程中的關(guān)鍵注意事項(xiàng)
微生物選擇：優(yōu)先選擇對(duì)數(shù)期菌體（活性高、表面基團(tuán)豐富，易固定）；
載體適配性：根據(jù)應(yīng)用場(chǎng)景選擇載體（如食品領(lǐng)域選天然載體海藻酸鈉，工業(yè)領(lǐng)域選耐酸耐堿的 PVA）；
反應(yīng)條件控制：避免高溫（>40℃）、極端 pH（<4 或> 10）和高濃度化學(xué)試劑，減少微生物活性損傷；
傳質(zhì)優(yōu)化：通過減小載體粒徑（如包埋法凝膠珠直徑 < 3 mm）、增加載體孔隙率（如選擇多孔陶瓷）降低傳質(zhì)阻力；
穩(wěn)定性測(cè)試：制備后需通過連續(xù)批次實(shí)驗(yàn)或流加實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證微生物是否脫落、活性是否保持（通常需監(jiān)測(cè) 3-7 天）。
綜上，固定化微生物制備方法的選擇需結(jié)合應(yīng)用目標(biāo)（如廢水處理、食品發(fā)酵）、微生物特性（如耐毒性、活性要求）及成本預(yù)算綜合判斷，其中包埋法因兼顧活性、穩(wěn)定性和載菌量，是目前工業(yè)應(yīng)用中最主流的方法。
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