培養(yǎng)基和無菌水制備的原理、材料、步驟及關(guān)鍵注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-11-10 09:46:43
百歐博偉生物：培養(yǎng)基和無菌水是微生物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域的基礎(chǔ)材料，其制備質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以下從制備原理、材料、步驟及關(guān)鍵注意事項(xiàng)等方面詳細(xì)介紹：
一、無菌水的制備
無菌水是指不含任何活的微生物的水，廣泛用于實(shí)驗(yàn)器具沖洗、培養(yǎng)基稀釋、微生物接種等場(chǎng)景。
（一）制備方法
常見的無菌水制備方法有高壓蒸汽滅菌法、過濾除菌法，其中高壓蒸汽滅菌法最為常用。
1、高壓蒸汽滅菌法
材料準(zhǔn)備：去離子水或蒸餾水、三角燒瓶、硅膠塞或棉塞、牛皮紙或鋁箔紙、高壓蒸汽滅菌鍋。
操作步驟：
量取適量去離子水或蒸餾水，倒入干凈的三角燒瓶中，通常不超過燒瓶容積的 1/2，避免滅菌時(shí)液體沸騰溢出。
瓶口塞入硅膠塞或經(jīng)滅菌處理的棉塞，棉塞需松緊適度，既能防止微生物進(jìn)入，又能保證通氣（滅菌時(shí)蒸汽流通）。
用牛皮紙或鋁箔紙包裹瓶口，固定棉塞或硅膠塞，防止滅菌后開蓋時(shí)空氣污染。
將包裹好的三角燒瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋，按照滅菌鍋操作說明，設(shè)定溫度 121℃、壓力 0.1MPa，滅菌 20-30 分鐘。
滅菌結(jié)束后，待滅菌鍋內(nèi)壓力降至常壓、溫度降至 80℃以下時(shí)，緩慢打開排氣閥，取出三角燒瓶，冷卻后置于無菌操作臺(tái)備用。
2、過濾除菌法
適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的場(chǎng)景（如某些需避免高溫的實(shí)驗(yàn)體系），使用 0.22μm 濾膜過濾器，將去離子水通過無菌過濾裝置過濾，收集濾液于無菌容器中，全程需在無菌環(huán)境下操作。
（二）關(guān)鍵注意事項(xiàng)
水源優(yōu)先選擇去離子水或蒸餾水，避免自來水中的雜質(zhì)、微生物影響無菌效果。
容器（三角燒瓶、試管等）需提前清洗干凈，無殘留污漬和洗滌劑。
滅菌過程中嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間，確保徹底殺滅微生物；滅菌后避免過早開蓋，防止冷空氣攜帶微生物污染。
無菌水儲(chǔ)存時(shí)需密封，置于陰涼無菌環(huán)境，短期內(nèi)使用，避免二次污染。
二、培養(yǎng)基的制備
培養(yǎng)基是人工配制的、適合微生物或細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，分為微生物培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)基等，以下以常用的微生物固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基為例介紹。
（一）微生物培養(yǎng)基制備的通用流程
1、配方設(shè)計(jì)與材料準(zhǔn)備
核心成分：碳源（如葡萄糖、蔗糖、蛋白胨）、氮源（如牛肉膏、酵母膏、硝酸銨）、無機(jī)鹽（如氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂）、生長(zhǎng)因子（如維生素、氨基酸，部分微生物必需），固體培養(yǎng)基需添加凝固劑（如瓊脂，添加量通常為 1.5%-2.0%）。
材料清單：各類營(yíng)養(yǎng)成分、去離子水或蒸餾水、燒杯、玻璃棒、天平、容量瓶、三角燒瓶、棉塞/硅膠塞、牛皮紙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH 計(jì)或精密 pH 試紙。
2、稱量與溶解
根據(jù)培養(yǎng)基配方，用分析天平準(zhǔn)確稱量各營(yíng)養(yǎng)成分，放入干凈的燒杯中。
加入適量去離子水，用玻璃棒攪拌均勻，置于酒精燈或電熱板上加熱（邊加熱邊攪拌），使所有成分完全溶解。
若為固體培養(yǎng)基，待其他成分溶解后，加入瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌至瓊脂完全融化，期間注意補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分。
3、pH 調(diào)節(jié)
待培養(yǎng)基冷卻至 40-50℃（避免高溫影響 pH 計(jì)電極或試紙精度），用 pH 計(jì)或精密 pH 試紙測(cè)定其 pH 值。
根據(jù)培養(yǎng)微生物的需求，用 1mol/L HCl 或 1mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH，通常細(xì)菌培養(yǎng)基 pH 為 7.0-7.2，真菌培養(yǎng)基 pH 為 5.5-6.0。
調(diào)節(jié)后補(bǔ)加去離子水至培養(yǎng)基的最終體積。
4、分裝
將調(diào)節(jié)好 pH 的培養(yǎng)基趁熱分裝到三角燒瓶、試管等容器中。
三角燒瓶分裝量不超過容積的 1/2，試管分裝量不超過試管高度的 1/3，便于滅菌時(shí)蒸汽流通和后續(xù)操作。
分裝時(shí)避免培養(yǎng)基沾污瓶口和外壁，若有沾污需用無菌水擦拭干凈。
5、滅菌
瓶口塞入棉塞或硅膠塞，包裹牛皮紙或鋁箔紙，放入高壓蒸汽滅菌鍋。
一般微生物培養(yǎng)基采用 121℃、0.1MPa，滅菌 20-30 分鐘；若培養(yǎng)基中含葡萄糖等熱敏感成分，可采用 115℃、0.06MPa，滅菌 20 分鐘，或采用過濾除菌法處理熱敏感成分后再與其他滅菌成分混合。
6、冷卻與凝固（固體培養(yǎng)基）
滅菌后取出培養(yǎng)基，若為試管培養(yǎng)基，可傾斜放置（形成斜面，增大接種面積），待其自然冷卻凝固；若為平板培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基冷卻至 50℃左右（手感不燙手），在無菌操作臺(tái)內(nèi)倒入無菌培養(yǎng)皿中，每皿約 15-20mL，水平放置待凝固后備用。
7、無菌檢驗(yàn)
取少量制備好的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中，在適宜溫度下培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，若無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基滅菌合格；若有菌落生長(zhǎng)，需重新制備。
（二）不同類型培養(yǎng)基的特殊要求
選擇性培養(yǎng)基：需在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加特定的抑制劑或篩選劑，如分離大腸桿菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，添加伊紅和美藍(lán)，抑制革蘭氏陽性菌生長(zhǎng)，同時(shí)使
大腸桿菌菌落呈現(xiàn)特定顏色。
鑒別培養(yǎng)基：添加特定的指示劑或底物，如糖發(fā)酵培養(yǎng)基中添加酚紅指示劑，根據(jù)微生物發(fā)酵糖產(chǎn)酸與否判斷其代謝特性。
細(xì)胞培養(yǎng)基：成分更復(fù)雜，含血清、生長(zhǎng)因子等熱敏感成分，需采用過濾除菌法處理血清等成分，且培養(yǎng)基制備后需在無菌環(huán)境下進(jìn)行分裝和儲(chǔ)存，避免污染。
（三）關(guān)鍵注意事項(xiàng)
所有實(shí)驗(yàn)器具需提前清洗、干燥，必要時(shí)進(jìn)行干熱滅菌（160-170℃，2-3 小時(shí)），避免器具攜帶污染物。
營(yíng)養(yǎng)成分稱量需準(zhǔn)確，尤其是微量元素和生長(zhǎng)因子，過量或不足會(huì)影響微生物生長(zhǎng)。
瓊脂融化時(shí)需緩慢加熱，避免局部過熱導(dǎo)致瓊脂焦糊，影響培養(yǎng)基質(zhì)量。
pH 調(diào)節(jié)需精準(zhǔn)，過酸或過堿會(huì)抑制微生物生長(zhǎng)繁殖。
滅菌后的培養(yǎng)基需及時(shí)使用，若長(zhǎng)期儲(chǔ)存，固體培養(yǎng)基可密封后置于 4℃冰箱，液體培養(yǎng)基需避免反復(fù)凍融，建議分裝后冷藏或冷凍保存。
三、共性關(guān)鍵要點(diǎn)
無菌環(huán)境控制：制備過程中，尤其是分裝、倒平板、無菌水取用等環(huán)節(jié)，需在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，操作人員需穿戴無菌手套、口罩，避免人為污染。
設(shè)備校準(zhǔn)：天平、pH 計(jì)、高壓蒸汽滅菌鍋等設(shè)備需定期校準(zhǔn)，確保參數(shù)準(zhǔn)確，如高壓蒸汽滅菌鍋需定期檢查壓力表和溫度傳感器，避免滅菌不徹底。
記錄追溯：詳細(xì)記錄培養(yǎng)基配方、稱量數(shù)據(jù)、滅菌參數(shù)、制備時(shí)間等信息，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果追溯和問題排查。
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