檢驗工作中無菌操作的核心原則與標準流程及質(zhì)量控制！
小楊 / 2025-11-12 10:27:22
百歐博偉生物：無菌操作是檢驗工作（涵蓋微生物檢驗、細胞檢驗、生物樣本檢測等）的核心基礎(chǔ)，其核心目標是防止環(huán)境中雜菌/污染物侵入樣本、培養(yǎng)基或?qū)嶒烍w系，同時避免樣本中目標微生物/細胞交叉污染，確保檢驗結(jié)果的準確性、可靠性和重復(fù)性。以下從“核心原則、標準操作流程、各場景專項要求、質(zhì)量控制與常見問題解決”四個維度，系統(tǒng)梳理無菌操作的全流程要求，兼顧規(guī)范性與實操性。
一、無菌操作的核心原則
隔離污染源：將實驗體系（樣本、培養(yǎng)基、試劑、實驗器材）與環(huán)境中的微生物（空氣、桌面、操作人員體表）物理隔離；
全程無菌化：實驗前對器材、試劑、環(huán)境滅菌，實驗中維持無菌狀態(tài)，實驗后規(guī)范處理廢棄物，形成“前 - 中 - 后”閉環(huán)；
避免交叉污染：不同樣本、不同批次實驗分開操作，專用器材不混用，操作人員手部/衣物不直接接觸無菌面；
最小暴露原則：無菌物品/體系的暴露時間、暴露面積最小化，減少污染概率。
二、無菌操作的標準流程（通用要求）
（一）實驗前準備：滅菌與環(huán)境優(yōu)化
1、實驗環(huán)境滅菌
核心區(qū)域：生物安全柜（BSC）、超凈工作臺是無菌操作的首選場所，使用前需開啟紫外燈照射 30 分鐘（注意：紫外燈僅殺滅表面微生物，無法穿透玻璃/塑料，且對人體有害，照射時需關(guān)閉柜門、人員撤離）；照射后通風 15-20 分鐘，避免紫外殘留。
輔助區(qū)域：實驗臺面用 75% 乙醇擦拭（從內(nèi)向外單向擦拭，避免來回交叉），地面、墻壁定期用含氯消毒劑噴灑消毒（每周 1-2 次）；
環(huán)境要求：無菌室/實驗室需保持密閉、干燥，溫度控制在 20-25℃，濕度 40%-60%；定期監(jiān)測空氣潔凈度（微生物檢驗實驗室需達到萬級潔凈度，局部百級，即生物安全柜內(nèi)）。
2、實驗器材滅菌
器材類型 滅菌方式 操作要求與注意事項
玻璃器皿（試管、培養(yǎng)皿、移液管） 干熱滅菌（160℃，2-3 小時）或高壓蒸汽滅菌（121℃，1.05kg/cm²，20 分鐘） 干熱滅菌前需洗凈烘干（無水分殘留，避免滅菌時炸裂）；高壓蒸汽滅菌需確保器材完全浸沒在蒸汽中，排氣徹底（排除冷空氣，否則溫度達不到設(shè)定值）
塑料器材（離心管、吸頭、培養(yǎng)瓶） 輻照滅菌（一次性器材）或高壓蒸汽滅菌（可重復(fù)使用塑料） 一次性無菌器材需檢查包裝完整性（無破損、無漏液），有效期內(nèi)使用；重復(fù)使用塑料器材滅菌后需密封保存，避免二次污染
培養(yǎng)基、緩沖液、試劑 高壓蒸汽滅菌（含糖類/熱敏成分用 115℃，15 分鐘；不含熱敏成分用 121℃，20 分鐘）或過濾滅菌（0.22μm 濾膜） 高壓滅菌后需快速冷卻（避免營養(yǎng)成分降解），過濾滅菌需使用無菌濾器，操作時濾器出口避免接觸非無菌表面
金屬器材（接種環(huán)、鑷子、剪刀） 灼燒滅菌（酒精燈外焰，燒至紅熱）或干熱滅菌 接種環(huán)每次使用前后均需灼燒，冷卻后再接觸樣本（避免高溫殺死目標微生物/細胞）；金屬器材滅菌后需放在無菌容器中保存
3、操作人員準備
著裝：穿戴無菌工作服（或隔離衣）、無菌手套、口罩、帽子，頭發(fā)、胡須需完全遮蓋（避免毛發(fā)脫落污染）；禁止佩戴首飾（戒指、手鐲等易殘留微生物）、穿拖鞋進入實驗室；
手部消毒：先用肥皂/洗手液流動水洗手（七步洗手法：掌心→手背→指縫→指背→拇指→指尖→手腕），擦干后用 75% 乙醇擦拭雙手（包括手腕以上 10cm），待乙醇揮發(fā)后戴無菌手套（手套需無破損，佩戴時避免接觸非無菌面，如桌面、衣物）；
狀態(tài)要求：操作人員需保持健康狀態(tài)，感冒、腹瀉或皮膚有傷口時避免參與無菌操作（傷口需用無菌紗布覆蓋，必要時戴雙層手套）；禁止在實驗室內(nèi)飲食、飲水、交談（避免飛沫污染）。
（二）實驗中操作：規(guī)范執(zhí)行與風險控制
1、無菌物品取用與處理
原則：所有無菌物品（培養(yǎng)基、吸頭、試管等）需在生物安全柜/超凈工作臺內(nèi)打開包裝，包裝開口朝向無菌區(qū)域，避免開口接觸非無菌面（如臺面、操作人員手套外側(cè)）；
取用工具：使用無菌移液管、移液器、鑷子等取用無菌物品，移液管尖端、鑷子尖端避免接觸任何非無菌表面；移液器需定期校準，吸頭與移液器桿緊密貼合（避免漏氣導(dǎo)致污染）；
培養(yǎng)基處理：熔化后的固體培養(yǎng)基需冷卻至 50-60℃（手感不燙手）時倒平板，倒平板時瓶口靠近酒精燈火焰（形成無菌區(qū)），每個培養(yǎng)皿倒 15-20ml，避免培養(yǎng)基濺出；倒好后靜置冷卻至凝固（約 30 分鐘），倒置存放（防止冷凝水滴落污染菌落）。
2、樣本接種與處理（核心操作）
火焰無菌技術(shù)：接種環(huán)、接種針使用前在酒精燈外焰燒至紅熱（全程在火焰上方 5-10cm 處操作，形成無菌氣流區(qū)），冷卻 30 秒（可接觸無菌培養(yǎng)基邊緣測試，無滋滋聲即可）后再接觸樣本；操作過程中，試管口、培養(yǎng)瓶口需通過火焰快速灼燒（旋轉(zhuǎn) 2-3 圈，殺滅瓶口微生物），開蓋后瓶口朝上傾斜 45°（避免灰塵落入），操作完畢后立即蓋蓋并再次灼燒瓶口；
移液操作：移液時移液器垂直操作，吸頭尖端不接觸容器內(nèi)壁、液面以下（避免交叉污染）；不同樣本使用不同吸頭，同一樣本不同稀釋度按從低濃度到高濃度順序操作；
樣本防護：處理含病原微生物的樣本（如臨床標本、致病性菌株）時，需在二級及以上生物安全柜內(nèi)操作，操作人員需穿防護服、戴護目鏡（防止樣本飛濺感染）；
避免過度暴露：無菌體系（如培養(yǎng)皿開蓋后、試管開蓋后）暴露時間不超過 1 分鐘，操作過程緊湊有序，減少不必要的動作（如頻繁開關(guān)柜門、走動）。
3、實驗器材擺放與管理
生物安全柜/超凈工作臺內(nèi)器材按“功能分區(qū)”擺放：左側(cè)為無菌物品區(qū)（培養(yǎng)基、吸頭、試管），中間為操作區(qū)（樣本處理、接種），右側(cè)為廢棄物區(qū)（污染吸頭、廢液缸），避免交叉污染；
非無菌物品（如手機、筆記本、試劑包裝盒）禁止放入操作區(qū)；
實驗過程中，手套若接觸非無菌面（如桌面、門把手），需立即更換手套或用 75% 乙醇擦拭手套消毒。
（三）實驗后處理：污染控制與廢棄物處置
實驗器材清潔與滅菌：
污染器材（如接種環(huán)、培養(yǎng)皿、離心管）需先浸泡在含氯消毒劑中 30 分鐘（殺滅病原微生物），再清洗、烘干、滅菌；
重復(fù)使用的玻璃器皿需用洗滌劑浸泡超聲清洗（去除殘留樣本/培養(yǎng)基），洗凈后烘干再滅菌；
廢棄物處理：
生物廢棄物（如污染的吸頭、樣本殘渣、培養(yǎng)基）需放入黃色醫(yī)療垃圾袋，密封后高壓蒸汽滅菌（121℃，20 分鐘），再按醫(yī)療廢物處理規(guī)定轉(zhuǎn)運；
化學廢棄物需分類收集，交由專業(yè)機構(gòu)處理，禁止直接排放；
環(huán)境終末消毒：實驗結(jié)束后，用 75% 乙醇擦拭生物安全柜/超凈工作臺臺面、移液器、鑷子等器材，開啟紫外燈照射 30 分鐘；實驗室內(nèi)通風換氣，記錄消毒時間、操作人員、實驗內(nèi)容（便于追溯）。
三、各檢驗場景的專項無菌操作要求
不同檢驗場景的無菌操作重點不同，以下針對核心場景給出具體要求：
（一）微生物檢驗（細菌、真菌、病毒分離與鑒定）
樣本處理：臨床樣本需在生物安全柜內(nèi)開啟，避免樣本飛濺；處理糞便樣本時，需戴雙層手套，操作后立即更換手套并消毒；
培養(yǎng)基接種：
平板劃線法：接種環(huán)每次劃線后需灼燒滅菌，冷卻后再劃線（避免殺死目標菌）；劃線時從邊緣向中心劃，線條清晰，避免重疊；
傾注平板法：樣本稀釋液與熔化冷卻的培養(yǎng)基混合時，瓶口需通過火焰滅菌，混合后快速搖勻（避免氣泡產(chǎn)生），靜置凝固后倒置培養(yǎng)；
菌落挑取：挑取單菌落后，接種環(huán)需立即灼燒滅菌；不同菌落需使用不同接種環(huán)，避免交叉污染；
病毒培養(yǎng)：需在三級生物安全柜內(nèi)操作（針對高致病性病毒），細胞培養(yǎng)瓶開蓋后需在火焰旁操作，避免病毒氣溶膠擴散。
（二）細胞培養(yǎng)（貼壁細胞、懸浮細胞）
試劑準備：培養(yǎng)基、血清、胰酶等試劑需在 4℃冰箱冷藏保存，使用前恢復(fù)至室溫（避免溫度驟變導(dǎo)致細胞損傷）；血清需過濾滅菌（0.22μm 濾膜），避免支原體污染；
細胞復(fù)蘇與傳代：
復(fù)蘇：凍存管從液氮罐取出后，立即放入 37℃水浴鍋快速解凍（1-2 分鐘內(nèi)融化），解凍后在生物安全柜內(nèi)打開，用無菌移液管轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻（避免劇烈震蕩）；
傳代：貼壁細胞用胰酶消化時，胰酶需預(yù)熱至 37℃，消化時間控制在 1-3 分鐘（根據(jù)細胞類型調(diào)整），消化后立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；離心后棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，接種至新培養(yǎng)瓶；
污染防控：
定期檢測培養(yǎng)基是否污染（觀察是否有渾濁、顏色變化、絮狀物）；
細胞培養(yǎng)過程中，若發(fā)現(xiàn)污染（如細菌污染導(dǎo)致培養(yǎng)基渾濁、真菌污染出現(xiàn)白色菌絲），需立即終止培養(yǎng)，污染樣本高壓滅菌后處理，避免擴散；
支原體檢測：每 1-2 周對細胞系進行支原體檢測（常用 PCR 法或熒光染色法），支原體污染后無明顯外觀變化，但會影響細胞生長和實驗結(jié)果，需嚴格防控。
（三）無菌檢驗（藥品、醫(yī)療器械、食品的無菌驗證）
環(huán)境要求：需在百級潔凈度的無菌室或隔離器內(nèi)操作，環(huán)境微生物監(jiān)測（沉降菌法）：每培養(yǎng)皿沉降 30 分鐘，菌落數(shù)≤1cfu / 皿；
樣本處理：藥品/醫(yī)療器械樣本需按《中國藥典》要求進行無菌采樣，采樣工具需滅菌，采樣過程中避免樣本接觸非無菌表面；
培養(yǎng)條件：需同時設(shè)置陽性對照（接種已知致病菌，如
金黃色葡萄球菌）和陰性對照（未接種樣本的培養(yǎng)基），培養(yǎng)后觀察對照組是否正常生長（陽性對照需生長，陰性對照需無菌落），否則實驗結(jié)果無效；
結(jié)果判斷：若供試品培養(yǎng)后無菌落生長，且對照組符合要求，判定為無菌；若有菌落生長，需進一步鑒定是否為污染菌或樣本本身攜帶的微生物。
四、無菌操作的質(zhì)量控制與常見問題解決
（一）質(zhì)量控制指標與監(jiān)測方法
控制指標 監(jiān)測頻率 監(jiān)測方法 合格標準
環(huán)境空氣潔凈度 每月 1 次 沉降菌法（培養(yǎng)皿暴露 30 分鐘，37℃培養(yǎng) 48 小時）或粒子計數(shù)器法 萬級環(huán)境：沉降菌≤10cfu/皿；百級區(qū)域（生物安全柜內(nèi)）：沉降菌≤1cfu/皿
器材滅菌效果 每批次滅菌后 生物指示劑法（如
嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子片，滅菌后培養(yǎng)，若孢子未生長則合格） 生物指示劑無生長，物理指標（溫度、壓力、時間）符合設(shè)定值
操作人員無菌操作規(guī)范性 每周 1 次（盲樣測試） 操作人員按標準流程操作后，在操作區(qū)放置空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察是否有菌落生長 空白培養(yǎng)基無菌落生長，表明操作無污染
培養(yǎng)基無菌性 每批次制備后 取部分培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃，48 小時），觀察是否有菌落生長 無菌落生長，培養(yǎng)基顏色、狀態(tài)正常（無渾濁、無沉淀）
（二）常見問題與解決方案
常見問題 可能原因 解決措施
培養(yǎng)基污染（渾濁、長菌） 1.滅菌不徹底（溫度/時間不足、冷空氣未排盡）；2.開蓋后暴露時間過長；3.操作人員手套污染 1.重新校準高壓滅菌鍋，確保溫度 121℃、時間 20 分鐘，滅菌后排氣 3 分鐘；2.開蓋后 1 分鐘內(nèi)完成接種/分裝；3.操作過程中定期用 75% 乙醇消毒手套，接觸非無菌面后立即更換
樣本交叉污染 1.不同樣本共用吸頭/接種環(huán)；2.樣本處理順序混亂（高濃度樣本污染低濃度樣本） 1.一人一樣本一吸頭，接種環(huán)每次使用后灼燒滅菌；2.按“低濃度→高濃度”順序處理樣本，樣本之間保持一定距離（≥10cm）
細胞培養(yǎng)支原體污染 1.血清未過濾滅菌；2.培養(yǎng)器材污染；3.操作人員攜帶支原體 1.血清使用前用 0.1μm 濾膜過濾滅菌；2.培養(yǎng)瓶/吸頭選擇無支原體認證產(chǎn)品；3.操作時戴口罩，避免飛沫污染，定期檢測細胞支原體
無菌操作后仍有雜菌生長 1.生物安全柜/超凈工作臺紫外燈失效；2.實驗環(huán)境濕度超標（>60%，利于微生物生長） 1.定期檢測紫外燈強度（≥70μW/cm²，否則更換）；2.開啟除濕機，將環(huán)境濕度控制在 40%-60%；3.增加環(huán)境消毒頻率（如每日用含氯消毒劑擦拭臺面）
五、關(guān)鍵注意事項與合規(guī)要求
法規(guī)依據(jù)：需符合《GB 4789.1-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 總則》《中國藥典 2020 年版 四部 無菌檢查法》《ISO 13485 醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系》等標準，確保操作合規(guī)；
人員培訓：操作人員需經(jīng)系統(tǒng)培訓（無菌操作原理、流程、應(yīng)急處理），考核合格后方可獨立操作；定期開展再培訓（每年 1-2 次），更新知識和技能；
應(yīng)急處理：若發(fā)生樣本泄漏（如病原微生物樣本濺出），立即用含氯消毒劑覆蓋泄漏區(qū)域（作用 30 分鐘），再清理污染物，清理過程中戴雙層手套、護目鏡，避免感染；
記錄追溯：詳細記錄每批實驗的 “環(huán)境消毒時間、滅菌參數(shù)（溫度/壓力/時間）、操作人員、樣本信息、對照實驗結(jié)果”，形成完整的追溯鏈條，便于問題排查。
六、總結(jié)
無菌操作的核心是“全程可控、全程無菌”，需從環(huán)境、器材、人員、操作四個維度建立標準化流程，同時通過定期監(jiān)測、盲樣測試、應(yīng)急演練等方式強化質(zhì)量控制。在實際檢驗工作中，需結(jié)合具體場景（微生物檢驗、細胞培養(yǎng)、無菌驗證）的專項要求，靈活調(diào)整操作細節(jié)，最終實現(xiàn)“零污染、零交叉、結(jié)果可靠”的目標。
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