瓊脂稀釋法的核心原理與操作流程及適用范圍與標準化要點！
小楊 / 2025-11-13 09:54:35
百歐博偉生物：瓊脂稀釋法是微生物藥物敏感性檢測的經(jīng)典方法，尤其適用于需氧菌、厭氧菌及真菌的最低抑菌濃度（MIC）測定，具有結果準確、重復性好、可批量檢測的特點，被 CLSI（臨床和實驗室標準協(xié)會）、EUCAST（歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會）等權威機構列為標準化方法之一。以下從核心原理、操作細節(jié)、質量控制、應用場景及優(yōu)化策略展開，為實驗室規(guī)范化操作提供系統(tǒng)指導。
一、核心原理
將不同濃度的抗菌藥物與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，制成含梯度藥物濃度的瓊脂平板；隨后將標準化的微生物菌液接種至平板表面，經(jīng)適宜溫度培養(yǎng)后，觀察細菌/真菌的生長情況。抑制微生物可見生長的最低藥物濃度，即為該菌株的 MIC 值，可直接用于判斷菌株對藥物的敏感（S）、中介（I）或耐藥（R）狀態(tài)。
關鍵邏輯：
藥物與瓊脂的均勻結合保證了藥物濃度的穩(wěn)定性，避免液體稀釋法中藥物擴散導致的濃度不均；
接種菌量的標準化是結果可靠的核心（需控制在特定范圍，如細菌 10? CFU/點，真菌 10³~10? CFU/點），確保生長抑制僅由藥物濃度決定。
二、適用范圍與局限性
1、適用對象
細菌：需氧菌（如腸桿菌科、葡萄球菌屬、鏈球菌屬）、厭氧菌；
真菌：念珠菌屬、曲霉屬等常見致病性真菌；
藥物類型：抗生素、抗真菌藥、抗菌肽等。
2、局限性
操作較繁瑣，耗時較長（細菌 16~20h，真菌 24~48h），不適用于緊急藥敏需求；
對苛養(yǎng)菌（如
嗜血桿菌屬、
淋病奈瑟菌）需特殊培養(yǎng)基，且藥物穩(wěn)定性需額外驗證；
難以檢測微量耐藥機制，需結合其他方法輔助確認。
三、標準化操作流程（以細菌藥敏為例）
1、實驗準備
（1）試劑與材料
抗菌藥物：標準品（純度≥98%），按 CLSI/EUCAST 標準確定稀釋濃度范圍（如青霉素對葡萄球菌的濃度梯度：0.125~128 μg/mL）；
培養(yǎng)基：MH 瓊脂（ Mueller-Hinton agar，需氧菌專用）、布氏瓊脂（厭氧菌專用），pH 需校準至 7.2~7.4（真菌培養(yǎng) pH 7.0~7.2）；
菌液制備工具：比濁管（0.5 麥氏單位）、無菌生理鹽水/肉湯、微量移液器（精度≥0.1 μL）；
接種工具：多點接種儀（推薦，可同時接種 8~12 個菌株）或無菌接種環(huán)（直徑 3mm）。
（2）儀器設備
恒溫培養(yǎng)箱（35±2℃，厭氧菌需厭氧培養(yǎng)箱）；
高壓蒸汽滅菌鍋（培養(yǎng)基滅菌）、干熱滅菌箱（玻璃器皿滅菌）；
超凈工作臺（無菌操作）；
比濁儀（替代麥氏比濁管，提高菌液濃度準確性）。
2、操作步驟（核心環(huán)節(jié) + 關鍵控制點）
步驟 1：抗菌藥物梯度稀釋（核心：濃度準確 + 無污染）
儲備液制備：用適宜溶劑溶解藥物標準品，配制成高濃度儲備液，分裝后 - 20℃避光保存（有效期 3~6 個月，具體按藥物穩(wěn)定性確定）；
工作液稀釋：取儲備液用 MH 肉湯進行倍比稀釋，制備所需濃度梯度，每個濃度設 1 管，每管體積 1 mL；
注意事項：
溶劑體積占比≤1%（避免溶劑對微生物生長的抑制）；
不穩(wěn)定藥物需現(xiàn)配現(xiàn)用，或在冰浴條件下操作。
步驟 2：含藥瓊脂平板制備（核心：藥物與瓊脂均勻混合）
培養(yǎng)基融化：將 MH 瓊脂加熱融化，冷卻至 45~50℃（手感不燙手，避免高溫破壞藥物活性）；
藥物添加與混合：取 1 mL 藥物工作液加入 9 mL 融化的 MH 瓊脂中，快速顛倒混勻（避免氣泡產(chǎn)生），立即倒入無菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm），每皿約 20 mL，水平放置待凝固（室溫 1~2h 或 4℃冷藏 30min）；
空白對照：設置不含藥物的 MH 瓊脂平板（僅加 1 mL 無菌肉湯），用于驗證菌液活性；
注意事項：
每批平板需標記藥物名稱、濃度、制備日期；
凝固后的平板 4℃密封保存，有效期≤7 天（含不穩(wěn)定藥物的平板需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
步驟 3：菌液標準化制備（核心：控制接種菌量）
挑取純菌落：從新鮮培養(yǎng)的平板上挑取 3~5 個形態(tài)一致的純菌落，接種至 5 mL MH 肉湯中，35℃振蕩培養(yǎng) 4~6h（對數(shù)生長期）；
濃度校準：取培養(yǎng)后的菌液，用無菌生理鹽水稀釋至 0.5 麥氏單位（相當于 1.5×10? CFU/mL），或用比濁儀直接測定（誤差≤10%）；
進一步稀釋：將 0.5 麥氏單位菌液用 MH 肉湯稀釋 100 倍，得到 1.5×10? CFU/mL 的菌液（最終接種濃度需為 10? CFU / 點）；
注意事項：
菌液制備后需在 15min 內接種，避免細菌死亡；
若為厭氧菌，需在厭氧環(huán)境下制備菌液，避免氧氣暴露。
步驟 4：接種與培養(yǎng)（核心：均勻接種 + 適宜培養(yǎng)條件）
接種方式：
多點接種儀：將標準化菌液加入接種儀樣品池，每塊平板可接種 8~12 個菌株，每個菌株接種 1~2 μL（相當于 10? CFU / 點），接種點直徑≤5mm；
接種環(huán)：用無菌接種環(huán)（直徑 3mm）蘸取菌液，在平板表面點種，每點接種量約 1 μL，避免劃破瓊脂表面；
培養(yǎng)條件：
需氧菌：35±2℃，有氧培養(yǎng) 16~20h；
厭氧菌：35±2℃，厭氧環(huán)境（85% N?、10% H?、5% CO?）培養(yǎng) 48h；
真菌：35℃，有氧培養(yǎng) 24~48h（念珠菌）或 72h（曲霉）；
注意事項：
接種后平板需倒置培養(yǎng)，避免冷凝水滴落影響菌落生長；
培養(yǎng)期間避免頻繁開關培養(yǎng)箱，保持溫度穩(wěn)定。
步驟 5：結果判讀（核心：準確識別 MIC 值）
觀察生長情況：培養(yǎng)結束后，首先檢查空白對照平板（需有明顯菌落生長，否則實驗無效）；
MIC 判讀標準：
細菌：以“完全抑制菌落生長（僅允許單個菌落或輕微菌膜，且面積≤接種點的 10%）”的最低藥物濃度為 MIC；
真菌：念珠菌以“菌落直徑≤1mm”的最低濃度為 MIC，曲霉以“無可見菌絲生長”的最低濃度為 MIC；
結果記錄：按 CLSI/EUCAST 標準將 MIC 值轉化為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）；
注意事項：
若出現(xiàn)“跳孔生長”（低濃度抑制、高濃度生長），需重新實驗；
對凝固酶陰性葡萄球菌，需排除污染，確保菌落純度。
四、質量控制（QC）要點（確保結果可靠的核心）
1、標準菌株驗證
每批實驗需同時接種 CLSI 推薦的標準質控菌株，驗證藥物濃度和培養(yǎng)條件的準確性：
要求：質控菌株的 MIC 值需在 CLSI 規(guī)定的參考范圍內，否則實驗結果無效。
2、培養(yǎng)基質量控制
外觀：融化后澄清透明，無沉淀、顆粒；
pH：7.2~7.4（需氧菌）、7.0~7.2（真菌），誤差≤0.2；
無菌性：每批培養(yǎng)基隨機取 3~5 皿，35℃培養(yǎng) 24h，無雜菌生長；
生長支持性：接種標準菌株后，菌落形態(tài)正常、生長良好（菌落直徑≥1mm）。
3、藥物質量控制
純度：使用≥98% 的藥物標準品，避免雜質影響 MIC 值；
穩(wěn)定性：定期驗證儲備液和工作液的穩(wěn)定性（如每月檢測 1 次儲備液的 MIC 值，與初始值對比，偏差≤2 倍稀釋度）；
濃度準確性：稀釋過程中使用校準過的移液器，避免體積誤差（允許誤差≤5%）。
4、操作過程質控
無菌操作：全程在超凈工作臺進行，避免雜菌污染（尤其是厭氧菌和真菌，污染后易誤判）；
接種菌量驗證：定期用傾注平板法計數(shù)接種后的菌液濃度，確保實際接種量在 10?±30% CFU / 點；
判讀人員培訓：多人復核判讀結果，避免主觀誤差（如對“輕微生長”的判斷標準統(tǒng)一）。
五、常見問題與解決方案
問題類型 可能原因 解決方案
質控菌株 MIC 值超標 藥物失效、培養(yǎng)基 pH 異常、接種菌量不當 更換藥物標準品，校準培養(yǎng)基 pH，重新標準化菌液濃度
平板上無菌落生長（空白對照也無） 菌液濃度過低、菌液死亡、培養(yǎng)基抑制生長 重新制備對數(shù)期菌液，驗證培養(yǎng)基生長支持性，縮短菌液放置時間
跳孔生長（低濃度抑制、高濃度生長） 藥物濃度不均、菌液污染、耐藥突變 重新制備含藥平板，確保藥物與瓊脂充分混勻；驗證菌液純度，必要時重新分離純菌落
所有濃度均無抑制（MIC＞最高濃度） 菌株耐藥、藥物濃度范圍設置過低 擴大藥物濃度范圍，結合其他方法檢測耐藥基因
所有濃度均完全抑制（MIC＜最低濃度） 藥物濃度過高、接種菌量不足 調整藥物濃度梯度（降低最低濃度），重新校準菌液濃度
六、應用場景與拓展
1、臨床應用
指導臨床合理用藥：通過測定致病菌的 MIC 值，為重癥感染選擇有效抗菌藥物，避免盲目用藥導致的耐藥性和治療失?。?/div>
耐藥性監(jiān)測：定期對臨床分離菌株進行藥敏試驗，分析地區(qū)性耐藥趨勢，為抗菌藥物使用政策制定提供數(shù)據(jù)支持。
2、科研應用
新藥研發(fā)：測定候選藥物對目標菌株的 MIC 值，評估抗菌活性，篩選有效藥物分子；
耐藥機制研究：通過比較耐藥株與敏感株的 MIC 差異，驗證耐藥基因的功能；
抗菌藥物聯(lián)合藥敏：采用棋盤法瓊脂稀釋法，測定兩種藥物聯(lián)合使用的 MIC 值，評估協(xié)同（FIC 指數(shù)≤0.5）、相加（0.5＜FIC≤1）、無關（1＜FIC≤2）或拮抗（FIC＞2）作用。
3、工業(yè)應用
食品微生物檢測：測定食品中致病菌（如
沙門氏菌、
李斯特菌）對防腐劑、抗菌劑的敏感性，優(yōu)化食品保鮮配方；
畜牧獸醫(yī)領域：檢測畜禽致病菌對抗菌藥物的 MIC 值，指導養(yǎng)殖業(yè)合理用藥，減少耐藥菌向人類傳播。
七、方法優(yōu)化與標準化建議
自動化與高通量改進：使用自動化瓊脂稀釋平板制備儀和菌落成像分析系統(tǒng)，減少人工操作誤差，提高檢測效率（可同時處理 96 孔平板，批量檢測菌株）；
培養(yǎng)基優(yōu)化：對苛養(yǎng)菌（如
流感嗜血桿菌），在 MH 瓊脂中添加 X/V 因子（10 μg/mL）或脫纖維羊血（5%~10%），增強生長支持性；
藥物穩(wěn)定性改進：對熱不穩(wěn)定藥物，采用過濾除菌（0.22 μm 濾膜）替代高壓滅菌，避免藥物降解；
八、總結
瓊脂稀釋法是微生物藥敏試驗的“金標準”，其核心優(yōu)勢在于結果準確、重復性強，適用于臨床診斷、科研和工業(yè)領域的 MIC 測定。實驗室操作中需嚴格控制藥物濃度、接種菌量、培養(yǎng)基質量和培養(yǎng)條件，通過標準化質控流程確保結果可靠。隨著自動化技術的發(fā)展，瓊脂稀釋法正逐漸向高通量、智能化方向升級，但其“梯度藥物 + 固體培養(yǎng)基”的核心原理仍為藥敏檢測的基礎，是耐藥性監(jiān)測和抗菌藥物合理使用的關鍵技術支撐。
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