生化試驗(yàn)的核心分類與典型方法及通用操作原則與注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-11-17 10:40:12
百歐博偉生物：生化試驗(yàn)是微生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等領(lǐng)域的核心技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)生物體內(nèi)（或體外培養(yǎng)體系中）的代謝產(chǎn)物、酶活性、物質(zhì)轉(zhuǎn)化等生化反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)微生物鑒定、細(xì)胞功能分析、疾病診斷、藥物篩選等目的。以下從核心分類、原理與操作細(xì)節(jié)、應(yīng)用場(chǎng)景、質(zhì)量控制四個(gè)維度，系統(tǒng)梳理生化試驗(yàn)的方法體系，突出實(shí)操性和標(biāo)準(zhǔn)化要求：
一、生化試驗(yàn)的核心分類及典型方法
按檢測(cè)對(duì)象和反應(yīng)類型，生化試驗(yàn)可分為微生物生化鑒定試驗(yàn)、細(xì)胞生化功能試驗(yàn)、臨床生化檢測(cè)試驗(yàn)三大類，每類包含多個(gè)經(jīng)典方法，具體如下：
（一）微生物生化鑒定試驗(yàn)（最常用，聚焦微生物代謝特征）
核心邏輯：不同微生物的酶系統(tǒng)不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解能力和代謝產(chǎn)物存在差異，通過(guò)檢測(cè)這些差異實(shí)現(xiàn)菌種鑒定（如細(xì)菌、真菌的屬種分類）。
試驗(yàn)類型 典型方法 原理 操作步驟（以細(xì)菌為例） 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
碳水化合物代謝試驗(yàn) 糖發(fā)酵試驗(yàn) 細(xì)菌分解糖類產(chǎn)生有機(jī)酸，使培養(yǎng)基 pH 降低，指示劑變色；若產(chǎn)氣體，可觀察到氣泡。 1.配置含糖發(fā)酵培養(yǎng)基（含特定糖類、酚紅指示劑）；2.無(wú)菌操作接種純培養(yǎng)細(xì)菌；3.37℃培養(yǎng) 18-24h；4.觀察培養(yǎng)基顏色和 Durham 管氣泡。 陽(yáng)性：培養(yǎng)基變黃（pH<6.8），產(chǎn)氣則 Durham 管有氣泡；陰性：培養(yǎng)基仍為紅色，無(wú)氣泡。
淀粉水解試驗(yàn) 細(xì)菌產(chǎn)生淀粉酶，分解培養(yǎng)基中的淀粉為麥芽糖/葡萄糖，碘液可與淀粉結(jié)合呈藍(lán)色，若淀粉被分解則藍(lán)色消失。 1.配置淀粉瓊脂平板；2.接種細(xì)菌（點(diǎn)種或劃線）；3.37℃培養(yǎng) 24-48h；4.平板表面滴加碘液，靜置 1min。 陽(yáng)性：菌落周圍出現(xiàn)無(wú)色透明圈；陰性：無(wú)透明圈，平板整體呈藍(lán)色。
蛋白質(zhì)/氨基酸代謝試驗(yàn) 吲哚試驗(yàn) 細(xì)菌分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合呈玫瑰紅色。 1.配置色氨酸肉湯培養(yǎng)基；2.接種細(xì)菌，37℃培養(yǎng) 24h；3.加入 Ehrlich 試劑 0.5mL，靜置 10min。 陽(yáng)性：培養(yǎng)基上層出現(xiàn)玫瑰紅色；陰性：無(wú)顏色變化。
酶活性試驗(yàn) 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 細(xì)菌產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，分解 H?O?生成 O?和 H?O，產(chǎn)生氣泡。 1.取細(xì)菌純培養(yǎng)物涂于載玻片；2.滴加 3% H?O?溶液 1-2 滴；3.立即觀察氣泡產(chǎn)生。 陽(yáng)性：10s 內(nèi)產(chǎn)生大量氣泡；陰性：無(wú)氣泡或極少氣泡。
氧化酶試驗(yàn) 細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)胞色素氧化酶，可將氧化酶試劑氧化為紫色化合物。 1.用無(wú)菌棉簽蘸取細(xì)菌純培養(yǎng)物；2.滴加氧化酶試劑 1 滴；3.觀察 10-30s 內(nèi)顏色變化。 陽(yáng)性：棉簽變?yōu)樽仙?；陰性：無(wú)顏色變化（注意：試劑本身易氧化，需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
（二）細(xì)胞生化功能試驗(yàn)（聚焦細(xì)胞代謝、酶活性、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)）
核心邏輯：檢測(cè)細(xì)胞在生理或病理狀態(tài)下的生化反應(yīng)，反映細(xì)胞功能完整性。
試驗(yàn)類型 典型方法 原理 關(guān)鍵操作細(xì)節(jié) 應(yīng)用場(chǎng)景
細(xì)胞酶活性檢測(cè) 乳酸脫氫酶（LDH）活性測(cè)定（比色法） LDH 催化乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，同時(shí)將 NAD?還原為 NADH，NADH 在 340nm 處有特征吸收峰，通過(guò)吸光度變化計(jì)算酶活性。 1.制備細(xì)胞裂解液；2.加入反應(yīng)底物；3.37℃孵育 10min，終止反應(yīng)；4.紫外分光光度計(jì)檢測(cè) 340nm 吸光度。 細(xì)胞損傷程度評(píng)估、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)。
堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定（PNPP 法） ALP 催化對(duì)硝基苯磷酸酯（PNPP）水解為對(duì)硝基苯酚（PNP），PNP 在 405nm 處有吸收峰，吸光度與酶活性正相關(guān)。 1.細(xì)胞裂解液與 PNPP 底物緩沖液混合；2.37℃孵育 30min；3.加入 NaOH 終止反應(yīng)；4.酶標(biāo)儀檢測(cè) 405nm 吸光度。 干細(xì)胞分化（如成骨細(xì)胞分化）、肝膽疾病診斷。
細(xì)胞代謝產(chǎn)物檢測(cè) 糖酵解產(chǎn)物（乳酸）檢測(cè)（酶法） 乳酸脫氫酶催化乳酸與 NAD?反應(yīng)，生成 NADH，通過(guò)熒光強(qiáng)度定量乳酸含量。 1.收集細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞勻漿；2.加入乳酸檢測(cè)試劑盒試劑（含 LDH、NAD?）；3.避光孵育 20min；4.熒光分光光度計(jì)檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng) 340nm，發(fā)射波長(zhǎng) 460nm）。 腫瘤細(xì)胞代謝表型分析、細(xì)胞缺氧狀態(tài)評(píng)估。
細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn) 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（GLUT）功能檢測(cè)（放射性同位素法） 細(xì)胞攝取 ¹?C - 葡萄糖，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)放射性強(qiáng)度，反映 GLUT 介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率。 1.細(xì)胞接種于 24 孔板，培養(yǎng)至匯合；2.無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓處理 2h；3.加入含 ¹?C - 葡萄糖的反應(yīng)液，37℃孵育 5-10min；4.冰浴終止反應(yīng)，洗滌細(xì)胞，裂解后檢測(cè)放射性計(jì)數(shù)（CPM）。 糖尿病相關(guān)研究、腫瘤細(xì)胞糖代謝調(diào)控。
細(xì)胞解毒功能試驗(yàn) 肝細(xì)胞 P450 酶活性檢測(cè)（熒光底物法） 肝細(xì)胞 P450 酶催化熒光底物代謝，生成熒光產(chǎn)物，熒光強(qiáng)度與酶活性正相關(guān)。 1.原代肝細(xì)胞或肝細(xì)胞系培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2.加入熒光底物，37℃孵育 1-2h；3.收集上清，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)。 藥物代謝研究、肝毒性評(píng)價(jià)、藥物相互作用分析。
二、生化試驗(yàn)的通用操作原則與注意事項(xiàng)（保證結(jié)果可靠性）
無(wú)論哪種生化試驗(yàn)，都需遵循以下標(biāo)準(zhǔn)化流程和質(zhì)量控制要求，避免誤差：
1、樣品制備的標(biāo)準(zhǔn)化
微生物樣品：需采用純培養(yǎng)物（通過(guò)平板分離獲得單菌落），避免雜菌污染；菌液濃度需一致（如標(biāo)準(zhǔn)比濁管校準(zhǔn)，常用 0.5 麥?zhǔn)蠞岫?，約 1.5×10? CFU/mL）。
細(xì)胞樣品：細(xì)胞純度≥90%，裂解液需新鮮制備（加入蛋白酶抑制劑如 PMSF，防止酶降解）；培養(yǎng)上清需離心去除細(xì)胞碎片（1000rpm，5min）。
臨床樣品：血液樣品需及時(shí)分離血清/血漿（采血后 2h 內(nèi)離心，避免溶血）；尿液樣品需新鮮采集（冷藏保存不超過(guò) 4h），避免污染。
2、試劑與培養(yǎng)基的質(zhì)量控制
試劑需在有效期內(nèi)使用，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)儲(chǔ)存（如酶類試劑需 - 20℃避光保存，避免反復(fù)凍融）；
培養(yǎng)基配制后需高壓滅菌（121℃，15-20min），冷卻后無(wú)菌分裝，接種前需做空白對(duì)照（未接種培養(yǎng)基培養(yǎng)后觀察，確認(rèn)無(wú)雜菌污染）；
指示劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免氧化失效。
3、反應(yīng)條件的精準(zhǔn)控制
溫度：多數(shù)細(xì)菌生化試驗(yàn)為 37℃，真菌為 28℃，細(xì)胞酶活性試驗(yàn)需嚴(yán)格控制孵育溫度（±0.5℃）；
時(shí)間：嚴(yán)格遵循孵育時(shí)間（如糖發(fā)酵試驗(yàn) 18-24h，超過(guò) 48h 可能因雜代謝產(chǎn)物導(dǎo)致假陽(yáng)性）；
pH：反應(yīng)體系 pH 需符合要求（如糖發(fā)酵培養(yǎng)基 pH7.2-7.4，酶活性試驗(yàn)需用特定緩沖液維持 pH 穩(wěn)定）。
4、結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)化
對(duì)照設(shè)置：每個(gè)試驗(yàn)需設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（已知陽(yáng)性菌株/標(biāo)準(zhǔn)品）、陰性對(duì)照（已知陰性菌株/空白試劑）、空白對(duì)照（無(wú)樣品的反應(yīng)體系），排除干擾；
定量試驗(yàn)：需做標(biāo)準(zhǔn)曲線（如酶活性、代謝產(chǎn)物檢測(cè)），標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度至少 3 個(gè)點(diǎn)，R²≥0.99；
定性試驗(yàn)：嚴(yán)格按照指示劑變色標(biāo)準(zhǔn)判斷（如酚紅變色范圍 pH6.8-8.4，避免主觀判斷誤差）。
5、常見(jiàn)誤差來(lái)源與解決方法
誤差類型 可能原因 解決方法
假陽(yáng)性 樣品污染、試劑失效、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 嚴(yán)格無(wú)菌操作；使用新鮮試劑；按時(shí)終止反應(yīng)。
假陰性 菌液濃度過(guò)低、酶活性受抑制、底物濃度不足 校準(zhǔn)菌液濃度；優(yōu)化反應(yīng)溫度；確保底物過(guò)量。
定量結(jié)果偏高/偏低 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制不準(zhǔn)確、樣品稀釋倍數(shù)錯(cuò)誤 標(biāo)準(zhǔn)品梯度均勻；稀釋時(shí)使用移液槍精準(zhǔn)操作，做平行樣。
重復(fù)性差 反應(yīng)條件不一致、樣品處理差異 統(tǒng)一緩沖液配方；樣品處理步驟標(biāo)準(zhǔn)化（如裂解時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速）。
三、生化試驗(yàn)的核心應(yīng)用場(chǎng)景
微生物學(xué)：細(xì)菌/真菌的屬種鑒定（如臨床病原菌鑒定、環(huán)境微生物篩選）、微生物代謝產(chǎn)物篩選；
細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞功能評(píng)估（如干細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞代謝表型）、藥物毒性檢測(cè)；
臨床醫(yī)學(xué)：疾病診斷（如糖尿病、肝炎、腎功能不全）、療效監(jiān)測(cè)（如化療后腫瘤標(biāo)志物變化）、健康體檢（血脂、血糖篩查）；
工業(yè)生物技術(shù)：發(fā)酵過(guò)程監(jiān)控（如糖消耗、產(chǎn)物生成）、酶制劑生產(chǎn)工藝優(yōu)化（如酶活性測(cè)定）；
環(huán)境科學(xué)：水體/土壤污染監(jiān)測(cè)（如微生物降解能力檢測(cè)、重金屬對(duì)酶活性的抑制）。
四、生化試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程（ISO/CLSI 參考）
為確保結(jié)果的可比性和合規(guī)性，國(guó)際上有明確的標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程，常用參考標(biāo)準(zhǔn)：
臨床生化：ISO 15189（醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則）、CLSI C28-A3（臨床化學(xué)試劑性能評(píng)價(jià)指南）；
微生物生化鑒定：CLSI M35-A2（微生物體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)）、ISO 6579（食品中沙門氏菌檢測(cè)方法）；
細(xì)胞生化：ISO 10993-5（醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第 5 部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)）。
遵循這些標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需重點(diǎn)關(guān)注：試劑校準(zhǔn)、設(shè)備驗(yàn)證（如分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀的定期校準(zhǔn)）、人員操作培訓(xùn)、實(shí)驗(yàn)記錄完整性（如樣品信息、反應(yīng)條件、結(jié)果數(shù)據(jù)）。
五、總結(jié)
生化試驗(yàn)的核心是通過(guò)特異性生化反應(yīng)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)或酶活性，其可靠性依賴于樣品制備標(biāo)準(zhǔn)化、反應(yīng)條件精準(zhǔn)控制、質(zhì)量對(duì)照完善。不同領(lǐng)域的生化試驗(yàn)雖有差異，但均需遵循“原理明確、操作規(guī)范、結(jié)果可重復(fù)”的原則。在實(shí)際應(yīng)用中，需根據(jù)檢測(cè)目的（如微生物鑒定、細(xì)胞功能分析、臨床診斷）選擇合適的方法，并結(jié)合具體場(chǎng)景優(yōu)化操作細(xì)節(jié)，同時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行質(zhì)量控制流程，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和合規(guī)性。
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