微生物單染色與革蘭氏染色的操作步驟拆解及原理對比！
小楊 / 2025-12-05 10:44:07
百歐博偉生物：單染色法和革蘭氏染色法是微生物學(xué)中最基礎(chǔ)、最常用的細胞形態(tài)觀察染色技術(shù)，前者操作簡便用于快速判斷微生物形態(tài)，后者為鑒別染色法可區(qū)分革蘭氏陽性（G?）和革蘭氏陰性（G?）菌，二者在實驗原理、操作步驟、結(jié)果解讀及應(yīng)用場景上差異顯著。以下是詳細的步驟拆解、原理對比及關(guān)鍵注意事項：
一、單染色法（Simple Staining）
1、核心原理
利用單一染料（多為堿性染料，如結(jié)晶紫、美藍、番紅）與微生物細胞表面的酸性物質(zhì)（如肽聚糖、核酸）結(jié)合，使細胞著色，背景透明，從而清晰觀察細胞的形態(tài)（球狀、桿狀、螺旋狀）、大小及排列方式（單個、成對、鏈狀、葡萄狀等）。特點：操作簡單、快速（5-10 分鐘完成），僅能區(qū)分細胞形態(tài)，無法鑒別細菌種類。
2、材料準備
染料：堿性染料（常用結(jié)晶紫染液、呂氏美藍染液）
其他：載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、酒精燈、無菌水、吸水紙、顯微鏡
3、操作步驟（以結(jié)晶紫單染色為例）
步驟 操作細節(jié) 目的與注意事項
載玻片準備 取干凈載玻片，在中央滴 1 滴無菌水（若為液體菌種可直接滴菌液） 載玻片需無油污，避免影響涂片均勻性
涂片 用無菌接種環(huán)挑取少量菌種，在無菌水中輕輕研磨并均勻涂布，形成薄而均勻的菌膜（直徑約 1cm） 涂片過厚會導(dǎo)致染色不均、觀察時重疊；涂片后自然風(fēng)干
固定 將風(fēng)干的載玻片快速通過酒精燈火焰 3 次（菌膜面朝上，以載玻片背面不燙手為宜） 固定目的：殺死細菌、使細胞黏附在載玻片上，防止染色后沖洗脫落
染色 滴加結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，染色 1-2 分鐘 染色時間不宜過長，避免背景著色過深
沖洗 用緩慢的流水從載玻片一端沖洗至染液無色（水流不可過急，避免沖掉菌膜） 沖洗方向：從菌膜上方輕輕沖洗，勿直接沖擊菌膜
干燥 用吸水紙吸去載玻片表面水分（勿摩擦菌膜），或自然風(fēng)干 干燥后再鏡檢，避免鏡頭污染
鏡檢 先低倍鏡找到菌落后，換高倍鏡或油鏡觀察 結(jié)果：細菌呈紫色，背景透明，可清晰觀察細胞形態(tài)和排列
二、革蘭氏染色法（Gram Staining）
1、核心原理
基于細菌細胞壁結(jié)構(gòu)差異：
G?菌：細胞壁肽聚糖層厚（20-80nm），交聯(lián)度高，無外膜，酒精脫水后肽聚糖層收縮，染料 - 碘復(fù)合物無法滲出，保持紫色；
G?菌：細胞壁肽聚糖層薄（2-3nm），交聯(lián)度低，有外膜（脂多糖 + 脂蛋白），酒精溶解外膜脂質(zhì)，肽聚糖層通透性增加，染料 - 碘復(fù)合物被洗脫，復(fù)染后呈紅色。
特點：鑒別染色法，可區(qū)分 G?和 G?菌，是微生物分類、鑒定的基礎(chǔ)方法（如食品微生物檢測中區(qū)分致病菌類型）。
2、材料準備
染料：結(jié)晶紫染液（初染）、盧戈氏碘液（媒染）、95% 乙醇（脫色）、番紅染液（復(fù)染）
其他：同單染色法（載玻片、接種環(huán)、酒精燈等）
3、操作步驟（標準流程）
步驟 操作細節(jié) 目的與關(guān)鍵注意事項
涂片 + 固定 同單染色法（涂片→風(fēng)干→火焰固定） 涂片必須薄而均勻，固定溫度不可過高，否則 G?菌易被誤判為 G?菌
初染 滴加結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，染色 1 分鐘后用流水沖洗至無色 初染使所有細菌均呈紫色（無特異性）
媒染 滴加盧戈氏碘液覆蓋菌膜，作用 1 分鐘后流水沖洗 碘與結(jié)晶紫形成穩(wěn)定的“染料 - 碘復(fù)合物”，增強染色穩(wěn)定性
復(fù)染 滴加番紅染液覆蓋菌膜，染色 1-2 分鐘后流水沖洗 復(fù)染僅對脫色后的 G?菌著色（紅色），G?菌已被結(jié)晶紫染色，復(fù)染顏色不影響結(jié)果
干燥 + 鏡檢 同單染色法（吸水紙吸干→油鏡觀察） 結(jié)果：G?菌呈紫色（如
金黃色葡萄球菌），G?菌呈紅色（如
大腸桿菌）
4、關(guān)鍵控制點（避免結(jié)果誤判）
菌種培養(yǎng)時間：需選用對數(shù)期細菌（培養(yǎng) 16-24 小時），老齡菌（>48 小時）G?菌細胞壁破損，易被脫色為紅色；
涂片厚度：過厚會導(dǎo)致脫色不均，中間部分 G?菌可能殘留紫色；
乙醇脫色：必須“逐滴添加 + 輕輕晃動”，確保脫色均勻，流出液無色后立即沖洗（不可延長時間）；
染液質(zhì)量：結(jié)晶紫需新鮮（變色后不可用），盧戈氏碘液需避光保存（失效后無媒染作用）。
三、單染色與革蘭氏染色的核心對比
對比維度 單染色法 革蘭氏染色法
染色目的 觀察細胞形態(tài)、大小、排列 鑒別 G?/G?菌，輔助菌種鑒定
染料數(shù)量 1 種（堿性染料） 4 種（初染 + 媒染 + 脫色 + 復(fù)染）
操作復(fù)雜度 簡單（7 步，5-10 分鐘） 復(fù)雜（8 步，15-20 分鐘）
結(jié)果解讀 單一顏色，僅顯形態(tài) 雙色結(jié)果（紫 = G?，紅 = G?），顯形態(tài) + 細胞壁類型
適用場景 快速初步觀察（如判斷是否為細菌、酵母菌） 菌種鑒定、臨床檢測、食品微生物篩查（如區(qū)分致病菌類型）
誤差風(fēng)險 低（僅需控制涂片和固定） 高（脫色、菌齡、染液質(zhì)量均影響結(jié)果）
四、常見問題與解決方案
問題現(xiàn)象 單染色法 革蘭氏染色法
細胞脫落 涂片未固定或固定不充分 同左，或涂片過厚
背景著色深 染色時間過長，未沖洗干凈 復(fù)染時間過長，或脫色不徹底
細胞形態(tài)模糊 載玻片有油污，或涂片過厚 菌齡過長（G?菌細胞壁破損），或乙醇濃度不當
五、應(yīng)用場景示例
單染色法：快速判斷食品樣品中是否存在微生物污染（如觀察飲料中是否有桿狀/球狀細菌）；
革蘭氏染色法：臨床痰液檢測（區(qū)分 G?肺炎鏈球菌和 G?流感嗜血桿菌，指導(dǎo)抗生素使用）、食品致病菌檢測（區(qū)分 G?金黃色葡萄球菌和 G?沙門氏菌）。
通過以上步驟操作，可準確完成兩種染色技術(shù)，其中革蘭氏染色的關(guān)鍵在于控制脫色時間和菌齡，建議初次操作時同時設(shè)置陽性（
金黃色葡萄球菌）和陰性（
大腸桿菌）對照，便于驗證結(jié)果準確性。
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