細(xì)菌類(lèi)微生物的冷凍干燥保藏，有哪些核心注意事項(xiàng)？
小楊 / 2025-12-15 10:03:38
百歐博偉生物：細(xì)菌類(lèi)微生物冷凍干燥保藏的核心注意事項(xiàng)，圍繞“提高存活率、保持菌株穩(wěn)定性、避免污染”三大目標(biāo)展開(kāi)，需覆蓋菌株預(yù)處理、保護(hù)劑選擇、凍干操作、后處理及復(fù)蘇全流程，不同類(lèi)型細(xì)菌（如革蘭氏陽(yáng)性/陰性、芽孢/非芽孢菌）需針對(duì)性調(diào)整。
一、凍干前：菌株預(yù)處理與保護(hù)劑適配（決定存活率的關(guān)鍵）
這一步是基礎(chǔ)，直接影響后續(xù)凍干效果，核心是讓細(xì)菌處于“最佳生理狀態(tài)”并匹配適配的保護(hù)劑。
1、菌株培養(yǎng)狀態(tài)控制
選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的細(xì)菌：此時(shí)細(xì)菌細(xì)胞活性高、抗逆性強(qiáng)，是凍干的最佳時(shí)期。
操作：通過(guò) OD 值監(jiān)測(cè)（如
大腸桿菌 OD???=0.8-1.0 時(shí)）或平板計(jì)數(shù)，確認(rèn)進(jìn)入對(duì)數(shù)后期；避免用穩(wěn)定期或衰亡期細(xì)菌（穩(wěn)定期細(xì)胞代謝減緩，衰亡期細(xì)胞大量死亡，凍干后存活率會(huì)下降 50% 以上）。
芽孢菌需誘導(dǎo)產(chǎn)芽孢：若保藏芽孢菌（如
枯草芽孢桿菌），需用特定培養(yǎng)基（如芽孢培養(yǎng)基）培養(yǎng)，確保芽孢形成率≥90%（通過(guò)芽孢染色鏡檢確認(rèn)），芽孢的抗凍脫水能力遠(yuǎn)強(qiáng)于營(yíng)養(yǎng)體，凍干后存活率可達(dá) 90% 以上，而營(yíng)養(yǎng)體僅 30%-50%。
厭氧菌需全程厭氧處理：如
雙歧桿菌、產(chǎn)甲烷菌，從培養(yǎng)到制成菌懸液，需在厭氧工作站（或厭氧袋）中操作，避免接觸氧氣導(dǎo)致細(xì)菌失活；菌懸液中可添加 0.1% 的 L - 半胱氨酸（還原劑），維持厭氧環(huán)境。
2、保護(hù)劑的精準(zhǔn)選擇（不同細(xì)菌適配不同配方）
保護(hù)劑能減少凍結(jié)時(shí)冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷、防止脫水導(dǎo)致的蛋白質(zhì)變性，是細(xì)菌凍干的“核心輔助劑”，需按細(xì)菌類(lèi)型分類(lèi)選擇：
細(xì)菌類(lèi)型 推薦保護(hù)劑配方 核心作用 注意事項(xiàng)
革蘭氏陽(yáng)性菌 10% 脫脂乳 + 5% 蔗糖；或 5% 甘油 + 0.5% 蛋白胨 脫脂乳提供蛋白保護(hù)細(xì)胞膜，蔗糖維持滲透壓 乳酸菌避免用高濃度甘油（>10%），會(huì)破壞其細(xì)胞膜
革蘭氏陰性菌 10% 胎牛血清 + 5% 葡萄糖；或 15% 脫脂乳 血清中的蛋白修復(fù)細(xì)胞膜損傷，葡萄糖提供能量 大腸桿菌、沙門(mén)氏菌需現(xiàn)配保護(hù)劑，血清反復(fù)凍融會(huì)產(chǎn)生沉淀，影響效果
芽孢菌（營(yíng)養(yǎng)體） 8% 脫脂乳 + 2% 甘露醇 甘露醇減少冰晶形成，保護(hù)芽孢外殼 若保藏芽孢，可簡(jiǎn)化為 5% 脫脂乳，芽孢抗逆性強(qiáng)，無(wú)需復(fù)雜保護(hù)劑
厭氧菌 15% 脫脂乳 + 0.1% L - 半胱氨酸 + 2% 葡萄糖 L - 半胱氨酸除氧，葡萄糖維持細(xì)胞活性 保護(hù)劑需提前通入氮?dú)獬?，避免氧氣殘?/div>
二、凍干中：關(guān)鍵參數(shù)控制（避免細(xì)胞損傷）
凍干過(guò)程分為預(yù)凍、升華干燥、解析干燥三步，每一步的參數(shù)（溫度、時(shí)間、真空度）需精準(zhǔn)控制，尤其要避免“大冰晶形成”和“過(guò)度脫水”。
1、預(yù)凍：緩慢降溫，防止大冰晶損傷
預(yù)凍溫度：需低于細(xì)菌的共晶點(diǎn)（多數(shù)細(xì)菌共晶點(diǎn)為 - 20℃~-30℃），推薦預(yù)凍溫度為 - 40℃~-50℃（比共晶點(diǎn)低 10℃~20℃），確保菌懸液完全凍結(jié)。
例外：革蘭氏陰性菌（如
假單胞菌）對(duì)低溫敏感，預(yù)凍溫度可適當(dāng)提高至 - 35℃~-40℃，避免細(xì)胞膜過(guò)度收縮。
預(yù)凍速率：控制在 1℃~2℃/ 分鐘的“緩慢降溫”，是減少大冰晶的核心。
原理：快速降溫（如直接放入 - 80℃冰箱）會(huì)形成大量小冰晶，但易聚集形成大冰晶，刺穿細(xì)胞膜；緩慢降溫讓水分有序凍結(jié)，形成細(xì)小均勻的冰晶，對(duì)細(xì)胞損傷小。
操作：可用程序降溫儀（設(shè)定 1℃/ 分鐘降至 - 50℃），無(wú)儀器時(shí)可先在 - 20℃冰箱放置 1 小時(shí)，再轉(zhuǎn)入 - 80℃冰箱放置 2-3 小時(shí)，模擬緩慢降溫。
預(yù)凍時(shí)間：確保安瓿瓶（或凍干管）內(nèi)的菌懸液完全凍結(jié)，且中心溫度達(dá)到預(yù)凍溫度，通常為 2-4 小時(shí)（根據(jù)裝液量調(diào)整，0.5mL 裝液量 2 小時(shí)即可，1mL 需 3-4 小時(shí)），未凍透會(huì)導(dǎo)致升華干燥時(shí)出現(xiàn)“噴瓶”（菌懸液沸騰溢出，污染且降低存活率）。
2、升華干燥與解析干燥：控制真空度和溫度，避免過(guò)度脫水
升華干燥（去除游離水）：
真空度：維持在 10-30 Pa（核心參數(shù)），真空度過(guò)低（>50 Pa）會(huì)導(dǎo)致升華速度慢，冰晶長(zhǎng)時(shí)間存在易損傷細(xì)胞；過(guò)高（<10 Pa）會(huì)導(dǎo)致水分過(guò)快升華，樣品溫度驟降，出現(xiàn)“凍干燒傷”（細(xì)胞皺縮）。
溫度：初期保持 - 30℃~-25℃（讓冰晶升華），待樣品表面出現(xiàn)“白色疏松層”（約 2-3 小時(shí)），緩慢升溫至 - 15℃~-10℃，持續(xù) 4-6 小時(shí)（根據(jù)裝液量調(diào)整，0.5mL 約 4 小時(shí)，1mL 約 6 小時(shí)），直至游離水基本去除（樣品重量不再下降）。
解析干燥（去除結(jié)合水）：
目的：將樣品含水量降至 5% 以下（含水量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌在儲(chǔ)存中代謝復(fù)蘇，易死亡），這一步是延長(zhǎng)保藏期的關(guān)鍵。
操作：升溫至 25℃~30℃，真空度維持在 5-10 Pa，持續(xù) 2-3 小時(shí)，用水分測(cè)定儀檢測(cè)樣品含水量（需取樣檢測(cè)，避免污染，可預(yù)留 1-2 支凍干管用于檢測(cè)），確認(rèn)≤5% 后結(jié)束干燥。
三、凍干后：密封與儲(chǔ)存（保持穩(wěn)定性，防止污染）
凍干后的細(xì)菌處于“休眠態(tài)”，對(duì)氧氣、潮氣、光照敏感，需快速處理并嚴(yán)格儲(chǔ)存。
1、快速密封，隔絕氧氣和潮氣
密封時(shí)機(jī)：凍干結(jié)束后，在真空狀態(tài)下立即密封安瓿瓶（或凍干管），避免樣品暴露在空氣中吸潮。
操作：若用安瓿瓶，可在真空凍干機(jī)的封口裝置中，用火焰熔封（注意避免高溫燙傷樣品，封口處距離樣品至少 1cm）；若用凍干管，可在真空下用硅膠塞密封，外層再用石蠟封口（適用于短期儲(chǔ)存，1-2 年）。
厭氧菌/敏感菌的特殊處理：如
雙歧桿菌、霍亂弧菌，密封時(shí)需向安瓿瓶?jī)?nèi)充入氮?dú)猓ǘ栊詺怏w），排出氧氣，防止氧氣導(dǎo)致細(xì)菌氧化失活；充氮后再熔封，可使保藏期延長(zhǎng) 30% 以上。
2、儲(chǔ)存條件控制
溫度：優(yōu)先選擇 - 20℃~-80℃冷凍儲(chǔ)存，保藏期最長(zhǎng)（革蘭氏陽(yáng)性菌可達(dá) 10 年以上，革蘭氏陰性菌 5-8 年）；若條件有限，4℃冷藏儲(chǔ)存（需密封嚴(yán)實(shí)），但保藏期會(huì)縮短（革蘭氏陽(yáng)性菌 2-3 年，革蘭氏陰性菌 1-2 年），且需每 6 個(gè)月檢查一次是否吸潮（樣品出現(xiàn)結(jié)塊即失效）。
避光與防震：儲(chǔ)存時(shí)需放入避光盒（避免光照導(dǎo)致細(xì)菌 DNA 損傷），且避免頻繁震動(dòng)（防止安瓿瓶破裂或樣品松動(dòng)吸潮）；標(biāo)簽需清晰標(biāo)注菌株名稱(chēng)、凍干日期、保藏人，避免混淆。
四、復(fù)蘇與驗(yàn)證（確保菌株活性和純度）
凍干后的細(xì)菌需通過(guò)復(fù)蘇驗(yàn)證，確認(rèn)活性和純度，避免后續(xù)使用時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。
1、正確復(fù)蘇，提高復(fù)活率
復(fù)蘇培養(yǎng)基選擇：用與菌株適配的培養(yǎng)基（如
大腸桿菌用 LB 培養(yǎng)基，乳酸菌用 MRS 培養(yǎng)基，芽孢菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基），培養(yǎng)基需提前滅菌并冷卻至 37℃左右（避免高溫殺死細(xì)菌）。
操作步驟：
無(wú)菌操作下打開(kāi)安瓿瓶（熔封的需用砂輪劃開(kāi)，注意防碎渣污染），加入 0.5-1mL 無(wú)菌生理鹽水（或培養(yǎng)基），輕輕搖晃，使凍干樣品完全溶解（避免劇烈震蕩，防止細(xì)胞破裂）。
將溶解后的菌液全部接種到培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)（厭氧菌需在厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)），革蘭氏陰性菌培養(yǎng) 12-24 小時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌培養(yǎng) 24-48 小時(shí)，芽孢菌需培養(yǎng) 48 小時(shí)以上（確保芽孢萌發(fā)）。
2、活性與純度驗(yàn)證
活性驗(yàn)證：通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定復(fù)蘇后的菌落數(shù)，計(jì)算存活率（存活率 = 復(fù)蘇后菌落數(shù)/凍干前菌落數(shù) ×100%），多數(shù)細(xì)菌存活率需≥50%（芽孢菌≥80%），若低于 30%，需排查凍干前培養(yǎng)狀態(tài)、保護(hù)劑配方或凍干參數(shù)是否有誤。
純度驗(yàn)證：觀察菌落形態(tài)（如
大腸桿菌為圓形、光滑、乳白色菌落），并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢（確認(rèn)細(xì)菌形態(tài)和革蘭氏屬性與原菌株一致），若出現(xiàn)雜菌菌落（形態(tài)不同）或鏡檢發(fā)現(xiàn)雜菌，需重新分離純化，避免污染菌株流入后續(xù)實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)。
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