微生物實驗室分離之雙層平板法的核心優(yōu)勢及實驗操作指南！
小楊 / 2026-02-02 10:44:06
百歐博偉生物：雙層平板法是微生物學(xué)中分離、純化噬菌體（噬菌體能侵染細(xì)菌）的經(jīng)典方法，也可用于篩選產(chǎn)溶菌酶的微生物、檢測微生物的溶菌活性，核心原理是利用上下兩層瓊脂的不同硬度，形成清晰的噬菌斑/溶菌圈，實現(xiàn)目標(biāo)微生物的精準(zhǔn)分離與計數(shù)，操作標(biāo)準(zhǔn)化強(qiáng)、結(jié)果辨識度高。
該方法的核心優(yōu)勢：上層軟瓊脂使噬菌體/溶菌微生物與宿主菌充分均勻接觸，噬菌斑/溶菌圈形態(tài)規(guī)則、邊界清晰，易觀察和挑?。幌聦佑箔傊瑸槲⑸锷L提供穩(wěn)定的營養(yǎng)基底，避免菌液擴(kuò)散，保證分離效果。
一、實驗原理
底層為硬瓊脂平板（瓊脂濃度 1.5%~2.0%），鋪于培養(yǎng)皿中凝固，作為宿主菌（如
大腸桿菌）和目標(biāo)微生物（
噬菌體）的生長基礎(chǔ)，提供充足營養(yǎng)且形態(tài)穩(wěn)定。
上層為軟瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂濃度 0.6%~0.7%），呈液態(tài)時與宿主菌菌懸液、待分離樣品（含噬菌體）充分混合，快速鋪于底層平板表面，凝固后形成薄而均勻的軟瓊脂層。
若樣品中含噬菌體，其會侵染上層的宿主菌，在菌苔上形成透明的噬菌斑（宿主菌被裂解后形成的空斑）；若為篩選溶菌微生物，目標(biāo)菌會分泌溶菌酶裂解周圍宿主菌，形成溶菌圈。
通過挑取單個噬菌斑/溶菌圈，可實現(xiàn)噬菌體/產(chǎn)溶菌酶微生物的純培養(yǎng)與分離。
二、實驗材料
（一）菌種與樣品
宿主菌：根據(jù)待分離噬菌體的宿主范圍選擇（如分離
大腸桿菌噬菌體用大腸桿菌 DH5α/BL21，分離金黃色葡萄球菌噬菌體用
金黃色葡萄球菌），提前活化至對數(shù)生長期（OD600≈0.5~0.6）。
待分離樣品：含噬菌體的樣品（如污水、糞便、土壤浸出液、發(fā)酵液上清）或待篩選的產(chǎn)溶菌酶微生物菌懸液/樣品稀釋液。
（二）培養(yǎng)基
需準(zhǔn)備底層硬瓊脂培養(yǎng)基和上層軟瓊脂培養(yǎng)基，兩者營養(yǎng)成分一致（適配宿主菌生長），僅瓊脂濃度不同，常用為LB 雙層培養(yǎng)基（適用于腸桿菌科噬菌體），也可根據(jù)宿主菌調(diào)整為 NA（營養(yǎng)瓊脂）、TSA（胰蛋白胨大豆瓊脂）等。
培養(yǎng)基類型 瓊脂濃度 狀態(tài) 作用
底層硬瓊脂 1.5%~2.0% 固態(tài)（高溫滅菌后冷卻至 50~55℃倒平板） 提供生長基底，防止菌液擴(kuò)散
上層軟瓊脂 0.6%~0.7% 半固態(tài)（滅菌后冷卻至 45~50℃，避免燙傷宿主菌） 使樣品與宿主菌充分接觸，形成清晰空斑/溶菌圈
注：培養(yǎng)基需提前高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），冷卻至指定溫度后使用，避免溫度過高導(dǎo)致宿主菌死亡或噬菌體失活。
（三）試劑與耗材
稀釋液：無菌生理鹽水（0.85% NaCl）、LB 液體培養(yǎng)基（用于樣品梯度稀釋）；
耗材：無菌培養(yǎng)皿（90mm，提前滅菌烘干）、無菌移液管（1mL、5mL）、無菌離心管（1.5mL、10mL）、無菌吸頭、酒精燈、三角瓶、恒溫水浴鍋、培養(yǎng)箱、無菌操作臺；
其他：試管架、記號筆、無菌涂布棒（備用）、冰盒（樣品暫存）。
（四）儀器設(shè)備
無菌超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱（37℃，適配多數(shù)細(xì)菌/噬菌體）、恒溫水浴鍋（45℃、55℃恒溫）、臺式離心機(jī)（可選，用于樣品預(yù)處理）、紫外分光光度計（可選，檢測宿主菌濃度）。
三、實驗前準(zhǔn)備（無菌操作核心）
所有玻璃器皿、耗材均需經(jīng)高壓蒸汽滅菌，烘干后置于無菌操作臺備用；
培養(yǎng)基滅菌后，分別倒入恒溫水浴鍋：底層培養(yǎng)基 50~55℃恒溫，上層培養(yǎng)基 45~50℃恒溫，保溫待用（避免凝固）；
宿主菌活化：從斜面菌種挑取單菌落，接種至 LB 液體培養(yǎng)基，37℃、180r/min 搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，冰浴暫存（1h 內(nèi)使用，保證菌活性）；
樣品預(yù)處理（關(guān)鍵步驟）：待分離樣品若為固體（如土壤），按 1:10 比例加入無菌生理鹽水，振蕩 30min 后靜置 10min，取上清；若為液體（如污水），4℃、8000r/min 離心 10min，取上清，去除樣品中的固體雜質(zhì)和雜菌，避免干擾分離結(jié)果；
無菌操作臺紫外滅菌 30min，通風(fēng) 10min 后開始操作，全程嚴(yán)格無菌。
四、標(biāo)準(zhǔn)操作步驟（以噬菌體分離為例）
步驟 1：倒底層硬瓊脂平板
用無菌移液管吸取15~20mL 冷卻至 50~55℃的底層硬瓊脂培養(yǎng)基，快速倒入無菌 90mm 培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻鋪滿皿底，水平放置于無菌操作臺，室溫靜置 20~30min，待培養(yǎng)基完全凝固，標(biāo)記皿底（樣品名稱、稀釋度、日期）。
注：培養(yǎng)基量需適中，過少易干裂，過多會導(dǎo)致上層軟瓊脂鋪展不均；凝固后的底層平板需當(dāng)天使用，避免吸水返潮。
步驟 2：樣品梯度稀釋
取無菌離心管，依次標(biāo)記 10?¹、10?²、10?³……10??，向每管加入 9mL 無菌生理鹽水；用 1mL 無菌移液管吸取 1mL 預(yù)處理后的樣品上清，加入 10?¹ 管，吹打混勻后，再從 10?¹ 管吸取 1mL 至 10?² 管，依次梯度稀釋，根據(jù)樣品中噬菌體濃度選擇合適稀釋度（通常選 10??~10??）。
注：梯度稀釋全程無菌，移液管每換一個稀釋度需更換，避免交叉污染；若為篩選溶菌微生物，樣品稀釋至 10?³~10??即可。
步驟 3：上層軟瓊脂混合液制備
取無菌試管，標(biāo)記對應(yīng)樣品稀釋度，向每管加入3~5mL 冷卻至 45~50℃的上層軟瓊脂培養(yǎng)基（體積根據(jù)培養(yǎng)皿大小調(diào)整，90mm 皿加 3~4mL）；
向試管中加入0.1~0.2mL 對數(shù)生長期的宿主菌菌懸液，輕輕吹打混勻（避免產(chǎn)生氣泡）；
再加入0.1mL 對應(yīng)稀釋度的樣品稀釋液，再次輕柔混勻（全程試管置于 45℃水浴鍋中，防止軟瓊脂凝固）。
關(guān)鍵注意：①上層軟瓊脂溫度不可超過 50℃，否則會殺死宿主菌和噬菌體；②混勻時避免劇烈振蕩，防止產(chǎn)生氣泡，氣泡會干擾噬菌斑觀察；③每一個稀釋度單獨制備一支上層軟瓊脂試管，不可共用。
步驟 4：鋪上層軟瓊脂
將混勻后的上層軟瓊脂混合液快速、均勻地倒在已凝固的底層平板表面，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使混合液鋪滿底層平板，無空白區(qū)域、無氣泡。水平放置于無菌操作臺，室溫靜置 10~15min，使上層軟瓊脂完全凝固。
注：鋪板動作要快，避免軟瓊脂在試管中凝固；若出現(xiàn)氣泡，可用無菌接種環(huán)輕輕挑破。
步驟 5：培養(yǎng)
將雙層平板倒置（防止培養(yǎng)過程中冷凝水滴落，沖散菌苔和噬菌斑），置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~24h（具體時間根據(jù)宿主菌生長速度調(diào)整，如大腸桿菌培養(yǎng) 12~16h 即可出現(xiàn)清晰噬菌斑）。
步驟 6：觀察與挑取單噬菌斑/溶菌圈
培養(yǎng)結(jié)束后，取出平板，在自然光或顯微鏡下觀察：菌苔為渾濁的背景，透明、圓形、邊界清晰的空斑即為噬菌斑（溶菌微生物則為溶菌圈）。用無菌接種環(huán)挑取單個形態(tài)規(guī)則的噬菌斑/溶菌圈，接種至含宿主菌菌懸液的 LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、180r/min 搖床培養(yǎng) 8~12h，使噬菌體增殖/溶菌微生物純培養(yǎng)，即為初篩的純培養(yǎng)物，可進(jìn)行后續(xù)的鑒定和純化。
五、純化與復(fù)篩（保證目標(biāo)微生物純度）
初篩得到的培養(yǎng)物可能含雜噬菌體/雜菌，需進(jìn)行3~5 次純化，操作如下：
將初篩培養(yǎng)物 4℃、8000r/min 離心 10min，取上清，按上述步驟進(jìn)行梯度稀釋、鋪雙層平板；
培養(yǎng)后挑取單個形態(tài)一致的噬菌斑/溶菌圈，再次接種至宿主菌菌懸液中培養(yǎng)；
重復(fù)操作，直至所有平板上的噬菌斑/溶菌圈形態(tài)、大小、透明度完全一致，即為純化的目標(biāo)微生物（噬菌體/產(chǎn)溶菌酶微生物）。
六、結(jié)果判定
（一）噬菌體分離結(jié)果
陽性結(jié)果：平板上出現(xiàn)透明、圓形、邊界清晰的噬菌斑，噬菌斑大小與噬菌體種類相關(guān)（小噬菌斑直徑 0.5~1mm，大噬菌斑直徑 2~3mm），無雜菌污染，菌苔均勻；
陰性結(jié)果：平板上全為渾濁菌苔，無透明空斑，說明樣品中無目標(biāo)噬菌體或噬菌體濃度過低；
污染結(jié)果：平板上出現(xiàn)雜菌菌落（形態(tài)與宿主菌不同）或噬菌斑形態(tài)不規(guī)則、邊界模糊，說明無菌操作不嚴(yán)格或樣品預(yù)處理不徹底。
（二）溶菌微生物篩選結(jié)果
陽性結(jié)果為菌苔上出現(xiàn)透明或半透明的溶菌圈，溶菌圈越大，說明微生物的溶菌活性越強(qiáng)；陰性結(jié)果為無溶菌圈，菌苔均勻渾濁。
七、關(guān)鍵注意事項（標(biāo)準(zhǔn)化操作 & 質(zhì)量控制）
（一）無菌操作（核心，避免污染）
全程在無菌超凈工作臺操作，操作前紫外滅菌，操作中酒精燈旁進(jìn)行，手、移液管、接種環(huán)等需經(jīng)常灼燒滅菌；
所有耗材、培養(yǎng)基均需徹底滅菌，避免雜菌污染導(dǎo)致菌苔混亂，無法識別噬菌斑/溶菌圈；
梯度稀釋和鋪板時，移液管、吸頭需一用一換，避免交叉污染。
（二）溫度控制（決定實驗成敗）
上層軟瓊脂溫度嚴(yán)格控制在45~50℃：溫度過高會使宿主菌死亡、噬菌體失活，導(dǎo)致無噬菌斑；溫度過低會使軟瓊脂提前凝固，無法鋪板，混合不均；
底層硬瓊脂溫度控制在 50~55℃，避免溫度過高燙壞培養(yǎng)皿，或過低導(dǎo)致凝固過快，鋪板不均。
（三）宿主菌與樣品處理
宿主菌需處于對數(shù)生長期：此階段菌活性最強(qiáng)，易被噬菌體侵染，靜止期菌活性低，會導(dǎo)致噬菌斑數(shù)量減少、形態(tài)不清晰；
樣品預(yù)處理需徹底：固體樣品充分振蕩浸提，液體樣品離心去雜質(zhì)，避免樣品中的固體顆粒、雜菌干擾噬菌體與宿主菌的接觸；
樣品稀釋度需合適：稀釋度過低，噬菌斑/溶菌圈過于密集（融合成斑），無法挑取單個；稀釋度過高，平板上無空斑或空斑數(shù)量過少，無法統(tǒng)計和分離。
（四）平板培養(yǎng)與觀察
平板需倒置培養(yǎng)：防止培養(yǎng)過程中冷凝水滴落，沖散上層軟瓊脂的菌苔和噬菌斑，導(dǎo)致結(jié)果混亂；
培養(yǎng)時間需適中：培養(yǎng)時間過短，噬菌斑/溶菌圈未形成；培養(yǎng)時間過長，宿主菌過度生長，會覆蓋小型噬菌斑，或雜菌大量繁殖導(dǎo)致污染；
觀察后的平板若需保存，置于 4℃冰箱，保存時間不超過 3d，避免噬菌斑變形、菌苔干裂。
（五）其他
軟瓊脂混合液避免產(chǎn)生氣泡：氣泡會在平板上形成空白點，易與噬菌斑混淆，挑取時需注意區(qū)分；
挑取單噬菌斑時，接種環(huán)需灼燒冷卻后使用，避免燙傷目標(biāo)微生物，挑取后及時接種至增殖培養(yǎng)基，防止噬菌體失活。
八、生物安全要求
實驗所用宿主菌若為條件致病菌/致病菌（如
金黃色葡萄球菌、
沙門氏菌），需在二級生物安全實驗室（BSL-2） 操作，嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)范；
實驗廢棄物（如污染的移液管、離心管、培養(yǎng)皿）需置于專用滅菌袋中，高壓蒸汽滅菌（121℃，30min）后再處理，避免微生物擴(kuò)散；
實驗結(jié)束后，無菌操作臺用 75% 乙醇擦拭消毒，紫外滅菌 30min，實驗臺面、儀器表面用 75% 乙醇消毒。
九、方法拓展應(yīng)用
噬菌體計數(shù)：通過統(tǒng)計不同稀釋度平板上的噬菌斑數(shù)量，計算樣品中噬菌體的效價（PFU/mL，噬菌斑形成單位/毫升），公式：效價 = 噬菌斑數(shù) × 稀釋倍數(shù) ×10（因加入樣品體積為 0.1mL）；
產(chǎn)溶菌酶微生物篩選：將待篩選微生物菌懸液代替噬菌體樣品，鋪于含宿主菌的雙層平板，通過溶菌圈大小篩選溶菌活性高的菌株；
噬菌體效價測定：雙層平板法是噬菌體效價測定的金標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果比單層平板法更準(zhǔn)確、重復(fù)性更好；
噬菌體宿主范圍鑒定：更換不同的宿主菌，采用雙層平板法，觀察是否形成噬菌斑，確定噬菌體的宿主特異性。
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