非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)主要是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(M.tuberculosis-complex，MTC)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，迄今已發(fā)現(xiàn)160多個種別[1]，同時還有新的種別不斷出現(xiàn)。NTM多侵犯有基礎(chǔ)肺部疾病、免疫力低下、合并HIV感染的人群引起全身多臟器和組織病變[2]，其中以肺部最為常見。研究顯示，NTM感染引起人類疾病的升高趨勢已受到關(guān)注[3,4]。但由于NTM廣泛存在于自然環(huán)境中，對常用的消毒劑不敏感，很容易污染未經(jīng)消毒的患者標(biāo)本(如痰液)和醫(yī)療實驗用品，引起假性感染和醫(yī)源性感染，給臨床NTM病的診療造成困擾。國外已有NTM肺病與臨床相關(guān)性方面的研究報道[5,6]，但國內(nèi)這方面研究較少。為此，本研究對成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心分枝桿菌培養(yǎng)的實驗資料進行統(tǒng)計分析，旨在了解NTM的感染耐藥情況及其與臨床的相關(guān)性，為臨床提供更有針對性防治和治療NTM疾病的科學(xué)依據(jù)。
對象與方法
一、研究對象
菌株來源于2014年1月至2015年12月成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心分枝桿菌實驗室接診患者標(biāo)本(主要來自四川地區(qū))和各防控督導(dǎo)點送檢標(biāo)本(青羊、錦江、成華、武侯、金牛、龍泉驛、青白江，新都、溫江、彭州、都江堰、崇州、邛崍、雙流、新津、蒲江、大邑、郫縣、金堂、簡陽、攀枝花、涼山等地區(qū))。對同一患者多次培養(yǎng)的菌株不進行重復(fù)計數(shù)。
二、研究方法
1．分枝桿菌培養(yǎng)及菌型鑒定：
分枝桿菌培養(yǎng)采用BACTEC MGIT960系統(tǒng)(美國BD公司)，標(biāo)本類型包括痰液、纖支鏡沖洗液以及各種體液和分泌物標(biāo)本。MTC與NTM分群主要采用改良羅氏培養(yǎng)基對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩羧酸酰肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)進行初步鑒定，同時再經(jīng)分子生物學(xué)TB-DNA (北京博奧生物有限公司)進行MTC與NTM的菌型鑒定。
2．NTM菌種鑒定：
采用基因芯片試劑盒(北京博奧生物有限公司)進行菌種鑒定，具體操作流程參照文獻[7]，超出鑒定范圍菌種采用16S rDNA基因序列分析(由北京博奧生物有限公司送檢)。
3．藥物敏感試驗：
采用WHO推薦的比例法(L-J固體培養(yǎng)法)進行9種抗結(jié)核藥利福平(RFP 40 mg/L)、異煙肼(INH 0.2 mg/L)、鏈霉素(Sm 4 mg/L)、乙胺丁醇(EMB 2 mg/L)、阿米卡星(Am 40 mg/L)、卷曲霉素(Cm 40 mg/L)、氧氟沙星(Ofx 2 mg/L)、卡拉霉素(Km 30 mg/L)、克拉霉素(Clr 8 mg/L)的耐藥性測試，由中國CDC國家參比實驗室提供人型H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株進行質(zhì)量控制。耐藥率＝耐藥菌株/總菌株數(shù)×100%。
三、NTM病的診斷和治療
參照2012年《非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識》[8]進行。
四、統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理，組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)果
一、一般資料
2014年1月至2015年12月共收集12 460例患者，分離出陽性菌株3 991株(陽性率32.0%)。菌種鑒定結(jié)果NTM 125株，其中來源痰液112株、纖支鏡沖洗液8株、尿液2株、膿分泌物1株、腦脊液1株、腹水1株。患者中男81例，女44例，年齡12～86歲，平均(50.3±18.1)歲，其中12～45歲53例、46～60歲29例、>60歲43例。
二、NTM菌種分布和耐藥情況分析
125株NTM進行種或復(fù)合群鑒定，種群分布有9種，其中胞內(nèi)分枝桿菌(37/125，29.6%)、鳥分枝桿菌(29/125，23.2%)、龜/膿腫分枝桿菌(42/125，33.6%)分離率較高，其次為偶然分枝桿菌(7/125，5.6%)和堪薩斯分枝桿菌(6/125，4.8%)，戈登分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌和猿分枝桿菌各分離1株，兩年間NTM種群排位順位無明顯變化。125株NTM藥物敏感試驗顯示，9種NTM對9種抗結(jié)核藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥，平均耐藥程度從高到低依次為INH最高，其次為RFP、Sm、OX、Am、Cm、EMB、Km和Clr 。不同NTM菌種中鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌對Sm、INH、RFP、OX和Am呈現(xiàn)高度耐藥。見表1。125株NTM中有21株(16.8%)對9種藥全部耐藥，有117株(93.6%)對INH和RFP同時耐藥，有78株(62.4%)耐4種以上藥，兩年間耐藥率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝3.88，P>0.05)。
三、NTM與臨床相關(guān)性研究
菌種鑒定后的125株NTM，其中87株進行了回顧性臨床相關(guān)性分析，其余38株或因外院或區(qū)縣送檢標(biāo)本病歷資料不全未納入分析。87例NTM感染者中男58例，女29例，中位年齡49.0歲。58例(58/87，66.7%)可能真正感染NTM并致病，其余29例因診斷依據(jù)不足、臨床治療效果不佳或死亡未納入分析范圍。58例患者中胞內(nèi)分枝桿菌(20/58，34.5%)、龜/膿腫分枝桿菌(20/58，34.5%)、鳥分枝桿菌(15/58，25.9%)分離率較高，堪薩斯分枝桿菌較少(3/58，5.2%)。58株菌對INH、RFP和Sm呈現(xiàn)高度耐藥，對Clr的耐藥率最低(26/58，44.8%)。58株菌中55株來自呼吸道(痰液50株、纖維支氣管鏡檢沖洗液5株)，2株來自泌尿系統(tǒng)，1株膿分泌物。43例患者抗酸染色陽性，15例陰性；34例多次NTM培養(yǎng)陽性，24例單次NTM培養(yǎng)陽性；均有不同程度咳嗽咳痰、發(fā)熱等臨床癥狀；胸部X線表現(xiàn)有不同程度肺部指征，27例有空洞形成；10例合并HIV感染，4例合并糖尿病和高血壓，9例合并肺氣腫，3例合并HBV感染，4例心臟病和2例NTM復(fù)治患者。2例患者死亡。10例HIV合并NTM感染者的標(biāo)本均來自呼吸道，部分病例呈現(xiàn)多部位播散性感染，病情較重，胸部X線片表現(xiàn)多樣化，空洞型改變比例相對較高。
討論
NTM是一群能引起人體廣泛疾病的分枝桿菌，臨床表現(xiàn)從輕微的自限性皮膚感染到危及生命的全身感染[9]。近年來，NTM的感染病例和從實驗室的分離率逐年增多[10,11,12]。由于地區(qū)差異，NTM分離率也存在一定的地域性，本研究結(jié)果顯示，NTM感染以中老年為主，男性多于女性。2014年1月至2015年12月NTM的分離率呈現(xiàn)上升趨勢，與國內(nèi)NTM的發(fā)病趨勢一致，低于2010年全國流調(diào)平均水平(22.9 %)[13]，高于2015年江蘇地區(qū)的2.35%[11]和2012年沈陽地區(qū)的1.87%[12]，與Shao等[10]的研究(3.37%)較為接近，呈現(xiàn)明顯的地域差異。李定越等[14]從2002年至2011年四川省2 356例陽性菌株中發(fā)現(xiàn)NTM分離率為10.65 %，與本研究有所差異，可能是研究人群和年限跨度不同的原因，也可能是與本實驗室的分離條件不同有關(guān)。
由于NTM菌種繁多，對多種抗結(jié)核藥天然耐藥，本研究125株NTM比例法藥物敏感試驗顯示對大多數(shù)抗結(jié)核藥耐藥，對INF和RFP的耐藥率高達99.2%和97.6% ，對INF和RFP同時耐藥的菌株達到117株，對EMB和Km耐藥率相對較低，分別為65.6%和58.4% 。NTM臨床診療指南指出Clr是近20年來治療NTM最重要的新藥，在本研究中Clr顯示其耐藥率最低(44.8%)，這也預(yù)示Clr有可能成為NTM治療過程中重要的抗菌藥物。NTM耐藥是一個非常嚴峻的問題，同時不同NTM生長情況和耐藥譜不同，反映NTM真實耐藥性的體外藥物敏感試驗也有待提升，這也是目前NTM治療效果不佳的原因。
鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(M.avium complex, MAC)包括鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌和鼠麻風(fēng)分枝桿菌等，MAC在人體內(nèi)定植后可引起多種疾病，肺部感染最為常見。龜-膿腫分枝桿菌群包括3個種，即龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和致免疫分枝桿菌，?？梢鸶鞣N感染，包括肺、皮膚等。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，NTM現(xiàn)有種群分布中MAC和龜/膿腫分枝桿菌是引起NTM肺病的主要菌種[5,10]。2015年Shao等[10]從60株NTM中分離出41株MAC和6株龜/膿腫分枝桿菌。同樣在本研究中分離的125例NTM也是以MAC(65/125, 52.0 %)和龜/膿腫分枝桿菌(43/125, 34.4%)為主，MAC當(dāng)中又以胞內(nèi)分枝桿菌較為常見，說明在本地區(qū)MAC和龜/膿腫分枝桿菌也是導(dǎo)致人類疾病的主要致病菌種。125株NTM菌種分布中也出現(xiàn)一小部分不常見的NTM (恥垢分枝桿菌、戈登分枝桿菌等)，它們引起人類感染的報道較少，常作為一類非致病性環(huán)境分枝桿菌污染水源，醫(yī)療器械等。
本研究對125例NTM患者進行回顧性臨床相關(guān)性分析，87例患者最后納入綜合分析，盡管在治療周期和隨訪觀察方面有待進一步持續(xù)跟進，綜合分析結(jié)果顯示有58例患者可能真正感染NTM并致病，58例可疑NTM菌株中MAC和龜/膿腫分枝桿菌作為主要致病菌種的格局仍然未變，另外有3例堪薩斯分枝桿菌引起的NTM肺病，有報道堪薩斯分枝桿菌與人類疾病相關(guān)[15] ，該菌最易侵犯的部位是肺，常侵犯晚期艾滋病患者，在本研究分離的3例堪薩斯分枝桿菌感染的患者中有2例即合并HIV感染。本研究中有2例患者死亡，均為老年，這可能是患者在合并多種基礎(chǔ)疾病的同時抗NTM治療不佳最終死亡的原因。在本次研究中58例可能真正感染NTM并致病的臨床病例中10例合并HIV感染，其中MAC 6例、龜/膿腫分枝桿菌2例、堪薩斯分枝桿菌2例，10例HIV合并NTM感染者的標(biāo)本均來自呼吸道，其呼吸道癥狀較明顯，部分病例呈現(xiàn)多部位播散性NTM感染，累及腹腔、心包等部位，病情較重，胸部X片表現(xiàn)多樣化，空洞型改變比例也相對較高，這可能是艾滋病患者在免疫功能低下的情況下，更易合并NTM感染的原因，結(jié)果提示MAC、龜/膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌是合并HIV感染的常見菌種。
綜上所述，2014年1月至2015年12月NTM在四川的發(fā)病率呈上升趨勢，對多種抗結(jié)核藥耐藥，NTM菌種分布和與人類疾病相關(guān)性方面以MAC和龜/膿腫分枝桿菌為主。雖然本次抽樣進行NTM與臨床相關(guān)性分析的患者數(shù)較少，同時在代表性和典型性方面有一定的局限性，但對本地區(qū)在防治和治療NTM疾病方面也是有所裨益。
中國微生物查詢網(wǎng)（www.family998.com）轉(zhuǎn)載于《中華傳染病雜志》2016年第9期