電子顯微鏡拍出細(xì)胞彩照！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2016-12-02 13:25:45
想象一下，假如世界失去了色彩，只剩下黑白灰的組合，我們眼前的風(fēng)景會變成什么樣？在電子顯微鏡下，我們所能看到的就是這樣一個(gè)世界。電子顯微鏡能幫助我們觀察微小的病毒、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，但它只能得到黑白的灰度圖片。
而在最近，加利福尼亞大學(xué)圣地亞哥分校的研究者們研發(fā)了一種新技術(shù)，使得“用電鏡拍彩照”成為了可能。他們用特殊染料標(biāo)記樣品，得到了多色的電鏡成像，這是怎么做到的呢？
沒有色彩的電鏡世界
在過去，光學(xué)顯微鏡帶領(lǐng)著人們第一次走進(jìn)了肉眼不可辨別的微觀世界，微生物和各種生命體內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)開始為人所知。不過，當(dāng)人們需要觀察更加微小的結(jié)構(gòu)時(shí)，光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)就顯得不夠用了：受到衍射的影響，光學(xué)顯微鏡的分辨極限大約在200nm，在此基礎(chǔ)上即使再去放大，也無法看到清晰的成像了。為進(jìn)一步提高分辨率，科學(xué)家們就用波長短得多的電子束替代了可見光，制造出了電子顯微鏡。電子顯微鏡使微觀成像的分辨達(dá)到了0.1nm，這項(xiàng)重要的技術(shù)的研發(fā)者1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。
電子顯微鏡也有自己的缺點(diǎn)：這是一個(gè)沒有色彩的黑白世界。可見光有不同色彩，我們也可以很方便地給生物組織的特定成分加上染色或是熒光標(biāo)記。而電鏡獲得的圖像是反映電子多少（即亮度）的“灰度圖”，其中沒有色彩信息。當(dāng)然，人們可以給電鏡圖片進(jìn)行后期上色，但這樣的上色并不能選擇性地突出所要觀察的結(jié)構(gòu)。如果原圖中的灰度差別不大，后期上色也會很難將它們分開。
這張色彩夢幻的噬菌體圖片來自透射電子顯微鏡，它的顏色就是“偽彩色”。
為了讓電鏡圖片更加“突出重點(diǎn)”，科學(xué)家們已經(jīng)做出了很多努力，例如加入重金屬來提高“對比度”。生物主要是由碳?xì)溲醯@樣比較輕的元素構(gòu)成，電子透過得到的圖像對比度較低（就像是一幅淡淡的鉛筆畫）。而如果用重金屬（如鋨、鈾或者鉛）把背景染成深色，或是讓它們與脂質(zhì)或蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合，就可以得到更加黑白分明的圖像。但是，這樣做依然無法重點(diǎn)區(qū)分特定的生物分子。還有科學(xué)家嘗試將這些重金屬顆粒與抗體結(jié)合，讓它們結(jié)合到特定的生物分子上去，但這種“標(biāo)簽”難以進(jìn)入細(xì)胞，因此適用范圍還是有限。
負(fù)染法示意圖。
為黑白圖像染上“顏色”
而這一次，研究者們帶來了一些為電鏡圖片“染色”的新思路。他們給染料分子連上了不同的鑭系金屬元素，并讓這些染料沉淀到特異性標(biāo)記的周圍。雖然電子顯微鏡下依然沒有真正意義上的色彩，但通過投射電子的能量損失不同，這些染料可以產(chǎn)生彼此區(qū)分的信號。這樣一來，就相當(dāng)于給樣品加上了不同的色彩標(biāo)簽。
研究者們將顯色劑二氨基聯(lián)苯與鑭系金屬耦合在一起，作為電子顯微鏡的“特制染料”。想要標(biāo)記生物分子時(shí)，就給對應(yīng)的抗體連上熒光集團(tuán)或是氧化酶分子，再通過光或者酶來誘發(fā)反應(yīng)，讓染料沉積到目標(biāo)周圍。在完成“染色”之后，再按照常規(guī)的氧化鋨負(fù)染以增強(qiáng)對比度，進(jìn)行電鏡成像。
Ln-DAB2染料和染色方法：用帶有氧化分子（紅色為熒光分子，綠色為辣根過氧化酶）的抗體特異性標(biāo)記目標(biāo)分子（圖中為紅色標(biāo)記線粒體和綠色標(biāo)記核膜），分別讓不同的Ln-DAB2染料在抗體附近原位氧化沉淀。再經(jīng)過常規(guī)樣品處理并分別成像，使用計(jì)算機(jī)處理得到彩色圖像。
在成像時(shí)，研究者用一束動能一致的電子投射到樣品上。當(dāng)電子通過樣品時(shí)，會與其中的原子發(fā)生碰撞，進(jìn)而損失一部分能量，在用不同染料處理過的地方，電子的能量損失會產(chǎn)生明顯的差異。通過檢測這些差異，就可以讓染色位置從背景中脫穎而出了。通過計(jì)算機(jī)處理，將不同染料對應(yīng)的信號分別轉(zhuǎn)換成不同的偽彩色，再與原始的黑白電鏡圖片疊加，這樣就得到了我們在開頭處看到的電鏡彩照。
彩色電鏡分別成像：A為傳統(tǒng)電鏡圖；C和D分別為標(biāo)記的線粒體和細(xì)胞膜；E是偽彩疊加圖
鬧了半天，顏色還是“假的”？的確，區(qū)分了能量差異，電子束依然沒有真正的顏色。不過，與“純靠想象”的后期上色相比，染料的標(biāo)記還是起了很大作用。論文作者證明，這種方法可以分別用于細(xì)胞和組織的染色，并足以將不同的分子標(biāo)記從傳統(tǒng)的黑白電鏡成像中分離出來。
彩色電鏡的應(yīng)用：星形膠質(zhì)細(xì)胞分享突觸結(jié)構(gòu)圖（F）；細(xì)胞透膜肽介導(dǎo)的內(nèi)吞囊泡圖（H）；新合成PKM在神經(jīng)元中的定位圖（D）
目前，這種方法還只能在拍出三種“色彩”：它們分別被標(biāo)記為紅色、綠色和黃色。研究者希望，將來還能加入更多顏色種類，進(jìn)一步提高圖像的對比度。
在過去二十年中，超高分辨熒光顯微成像技術(shù)正突破著光學(xué)顯微鏡的成像極限，而現(xiàn)在，電子顯微鏡的世界也變得多彩了起來。這些技術(shù)的進(jìn)步都將帶領(lǐng)科學(xué)家們更深入地了解細(xì)胞內(nèi)部的精細(xì)構(gòu)造，揭開更多微觀世界的生命奧秘?！ ?