材料、設(shè)備及試劑
一、材料
外源DNA段:自行制備的帶限制性末端的DNA溶液,濃度已知;載體DNA:T-vector(Ampr,lacZ),自行提取純化,濃度已知;宿主菌:E.coliDH5α,或JM系列等具有α-互補能力的菌株。
二、設(shè)備
恒溫搖床，臺式高速離心機，恒溫水浴鍋，瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電泳儀無菌，工作臺，微量移液槍，eppendorf管。
三、試劑
1、連接反應(yīng)緩沖液(10×)：0.5mol/LTris?Cl(pH7.6)，100mol/LMgCl2，100mol/L二硫蘇糖醇(DTT)(過濾滅菌），500μg/ml牛血清清蛋白(組分V.Sigma產(chǎn)品）（可用可不用），10mol/LATP（過濾滅菌）。
2、T4DNA連接酶(T4DNAligase)；購買成品。
3、X-gal儲液(20mg/ml):用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的儲液,包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞,儲存于-20℃。
4、IPTG儲液(200mg/ml):在800μl蒸餾水中溶解200mgIPTG后,用蒸餾水定容至1ml,用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝于eppendorf管并儲于-20℃。
5、含X-gal和IPTG的篩選培養(yǎng)基：在事先制備好的含50μg/mlAmp的LB平板表面加40mlX-gal儲液和4μlIPTG儲液,用無菌玻棒將溶液涂勻,置于37℃下放置3-4小時,使培養(yǎng)基表面的液體完全被吸收。