在自然界里，食用菌都不是單獨(dú)存在的，而是和許多細(xì)菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所謂菌種分離，就是把這些和食用菌一起生活的雜菌分離出來(lái)，通過(guò)培養(yǎng)，獲得純的優(yōu)良菌種。菌種分母種、原種、栽培種。
母種的分離培養(yǎng)
食用菌母種的分離，可分為孢子分離法、組織分離法以及基內(nèi)菌絲分離等。
孢子分離法
孢子分離法，是用食用菌的有性孢子或無(wú)性孢子萌發(fā)成菌絲，培養(yǎng)成菌種的方法。這種菌種生活力較強(qiáng)，但孢子個(gè)體之間有差異，且自然分化現(xiàn)象較嚴(yán)重，變異大，需經(jīng)出菇試驗(yàn)才能在生產(chǎn)上應(yīng)用。
?。╨）單孢分離法：是每次或每支試管只取一個(gè)擔(dān)孢子，讓它萌發(fā)成菌絲體來(lái)獲得純菌種的方法。蘑菇和草菇用單孢分離得到的菌絲，有結(jié)實(shí)能力，可采用此法分離生產(chǎn)純菌種。單孢分離生產(chǎn)上較少采用，而且技術(shù)復(fù)雜，一般采用多孢分離法。
（2）多孢分離法：就是把許多孢子接種在同一培養(yǎng)基上，讓它們萌發(fā)、自由交配來(lái)獲得食用菌純菌種的一種方法。具體操作方法，有以下幾種：
?、俜N菇孢子彈射法：選擇個(gè)體健壯、朵形圓正，無(wú)病蟲(chóng)害、出菇均勻、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，適應(yīng)性強(qiáng)的八九分成熟的種菇，切去大部分，菌柄用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍后再用已滅菌的紗布或脫脂棉、濾紙吸干表面水分。在接種箱或無(wú)菌室內(nèi)，把種菇的菌褶朝下用鐵絲倒掛在玻璃漏斗下面，漏斗倒蓋在培養(yǎng)皿上面；上端小孔用棉花塞住。培養(yǎng)皿放在一個(gè)鋪有紗布的搪瓷盤(pán)上，靜置12～20小時(shí)，菌褶上的孢子就會(huì)散落在培養(yǎng)皿內(nèi)。形成一層粉末狀孢子?。ㄆ焦綐O淡紫色，蘑菇、草菇為褐色，香菇、金針菇孢子印白色）。用接種針沾取少量孢子在試管中的瓊脂外面或培養(yǎng)皿上劃線接種。待孢子萌發(fā)，生成菌落時(shí)，選孢子萌發(fā)早、長(zhǎng)勢(shì)好的菌落進(jìn)行試管培養(yǎng)。
還可用孢子采集器收集孢子。方法是選好種菇后，按上述程序，輕輕掀開(kāi)玻璃鐘罩，將種菇柄朝下插在孢子采收器的鋼絲架上，放在培養(yǎng)皿正中央。隨即蓋好玻璃罩，用紗布將鐘掌周圍塞好。并在紗布上倒少許升汞或無(wú)菌水。移入20℃左右恒溫箱培養(yǎng)。
?、隈奚贤磕ǚǎ喊礋o(wú)菌操作分離時(shí)；應(yīng)選擇成熟的種菇，用接種針直接插入褶片之間，輕輕抹取褶片表面子實(shí)體尚未彈射的孢子，再在培養(yǎng)基上劃線接種。
③鉤懸法：取成熟菌蓋的幾片菌褶或一小塊耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用無(wú)菌不銹鋼絲（或鐵絲、棉線等其他懸掛材料）懸掛于三角瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基的上方，勿使接觸到培養(yǎng)基或四周瓶壁。置適宜溫度下培養(yǎng)、轉(zhuǎn)接即可。
?、苜N附法：按無(wú)菌操作將成熟的菌褶或耳片取一小塊，用溶化的瓊脂培養(yǎng)基或阿拉伯膠、漿糊等貼附在配管斜面培養(yǎng)基正上方的試管壁上。經(jīng)6～12小時(shí)的培養(yǎng)，待孢子落在斜面上，立即把孢子連同部分瓊脂培養(yǎng)基移植到新的試管中培養(yǎng)即可。
孢子分離得到的母種、必須進(jìn)一步提純復(fù)壯，當(dāng)母種定植一星期左右，菌絲布滿斜面時(shí)，選擇菌絲健壯、生長(zhǎng)旺盛無(wú)老化、無(wú)感染雜茵的母種試管，進(jìn)而轉(zhuǎn)管擴(kuò)大，一般到栽培種，轉(zhuǎn)管不宜超過(guò)5次。
孢子分離得到的母種，必須通過(guò)出菇試驗(yàn)，鑒定為優(yōu)質(zhì)菌種后，才可供生產(chǎn)使用。
一般菌類如蘑菇、平菇、鳳尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分離法獲得母種。
現(xiàn)就銀耳孢子分離略述于下：
按無(wú)菌操作獲取種耳后，懸掛種耳的三角瓶經(jīng)12小時(shí)培養(yǎng)后，瓶底培養(yǎng)基表面就有"孢子印"。取出種耳，置20℃—25℃溫箱培養(yǎng)2～3天，培養(yǎng)基表面會(huì)出現(xiàn)乳白色透明的糊狀小菌落，就是銀耳的酵母狀分生孢子形成的少量銀耳菌絲。此時(shí)移接入試管斜面培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)滿斜面后，再移接入營(yíng)養(yǎng)豐富，且表面比較干燥的培養(yǎng)基上。經(jīng)30天左右，菌落長(zhǎng)出白色菌絲。
銀耳的酵母狀分生孢子、菌絲只有與羽毛狀菌絲的子囊菌（香灰菌絲）混合培養(yǎng)時(shí)，由后者幫助分解木材及其他一些纖維物質(zhì)，提供營(yíng)養(yǎng)，才能利于銀耳孢子萌發(fā)，菌絲的定植和子實(shí)體的形成。
在兩種菌絲交會(huì)時(shí)，先選出兩種純菌絲。
羽毛狀菌絲要純化選育，一般要選取生長(zhǎng)迅速，爬壁力強(qiáng)的試管斜面或種瓶，取先端菌絲，轉(zhuǎn)管移接，置25℃—28℃上培養(yǎng)，重復(fù)轉(zhuǎn)管幾次即可得到優(yōu)良純種。
銀耳菌絲的特點(diǎn)，菌絲生長(zhǎng)緩慢，擔(dān)孢子也不易萌發(fā)。在進(jìn)行兩菌混合時(shí)，先取經(jīng)8～I(xiàn)O天培養(yǎng)的銀耳菌絲斜面，按無(wú)菌操作方法在該斜面上距銀耳菌絲約0.5厘米處接入一小塊羽毛狀菌絲。置25℃下培養(yǎng)1周即得到混合好的銀耳母種。
2．組織分離培養(yǎng)法
利用子實(shí)體內(nèi)部組織，進(jìn)行無(wú)性繁殖而獲得母種的簡(jiǎn)便方法，即組織分離。該法操作簡(jiǎn)便，菌絲生長(zhǎng)發(fā)育快，品種特性易保存下來(lái)，特別是雜交育種后，優(yōu)良菌株用組織分離法能使遺傳特性穩(wěn)定下來(lái)。常采用以下分離方法。
?。╨）子實(shí)體分離：種菇要選朵大蓋厚，柄短，八九分成熟的優(yōu)良品種。切去菇兩基部，在無(wú)菌箱內(nèi)以0.1％的升汞水浸幾分鐘，再用無(wú)菌水沖洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌蓋與菌柄2次，進(jìn)行表面消毒。接種時(shí)，只要將種菇撕開(kāi)，在萌蓋和菌柄交界處或菌褶處，挑取一小塊組織；移接到PDA培養(yǎng)基上。置25℃左右溫度下培養(yǎng)3-5天，就可以看到組織上產(chǎn)生白色絨毛狀菌絲，轉(zhuǎn)管擴(kuò)大即得到菌種。如香菇、平菇等可以用此方法。
?。?）菌核分離：茯苓、豬苓、雷丸等菌的子實(shí)體不易采集。而常見(jiàn)的是它貯藏營(yíng)養(yǎng)的菌核。用菌核分離，同樣可以獲得菌種。方法是將菌核表面洗凈，用酒精或升汞消毒后，切開(kāi)菌核，取中間組織一小塊，約黃豆大小，接種在PDA培養(yǎng)基斜面上，保溫培養(yǎng)。應(yīng)注意的是，菌核是貯藏器官，大部分是多糖類物質(zhì)，只含有少量的菌絲，因此挑取的組織塊要大一些，如果組織塊過(guò)小，則不易分出菌種。
（3）菌素分離：有一部分子實(shí)體不易找到，也沒(méi)有菌核，可以用菌素進(jìn)行分離。如蜜環(huán)菌、假蜜環(huán)菌。其操作方法是先用酒精或升汞將菌素表面黑色皮層輕輕擦拭2～3次，然后去掉黑色外皮層（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用無(wú)菌剪刀將菌髓剪一小段，接種在培養(yǎng)基上，保溫培養(yǎng)，即得該菌菌種。
菌素分離要注意：因菌素比較細(xì)小，分離素也比較細(xì)小，分離時(shí)極易污染雜菌，所以要嚴(yán)格操作。
3．基內(nèi)菌絲分離培養(yǎng)法
利用食用菌生育的基質(zhì)作為分離材料，來(lái)得到純菌種的一種方法，叫基內(nèi)菌絲分離法。
此種分離方法是適宜只有在特定的季節(jié)才出現(xiàn)，而且是朝生暮死，不易采得的子實(shí)體?；鶅?nèi)分離法與組織分離法不同之點(diǎn)是，干燥的菇木或耳木中的菌絲常呈休眠狀態(tài)。接種后有時(shí)并不立刻恢復(fù)生長(zhǎng)。因此，有必要保留較長(zhǎng)的時(shí)間（約1個(gè)月），以斷定菌絲是否能成活?；鶅?nèi)菌絲分離法又可分為，材中菌絲分離（即菇木或耳木分離法）及土中菌絲分離法等。
?。?）材中菌絲分離法：就是菇木或耳木分離法，為了減少雜菌的感染，菇（耳）木在分離之前，必須進(jìn)行無(wú)菌處理?？梢园压剑ǘ┧砻嬗镁凭珶艋鹧孑p輕燒過(guò)，以燒死霉菌的孢子，或再用0.1％的升汞水浸孢幾分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗后用無(wú)菌濾紙吸干。接種塊切取時(shí)應(yīng)注意。接種塊必須在該菌菌絲分布的范圍內(nèi)切取。所以，菌絲生長(zhǎng)緩慢的種類應(yīng)淺取；菌種生長(zhǎng)快的種類可以深取。同時(shí)。還應(yīng)根據(jù)菇菌的種類、木材質(zhì)地、菇（耳）木粗細(xì)、發(fā)育時(shí)間的長(zhǎng)短來(lái)確定菌絲分布的范圍。然后用一把利刀進(jìn)行切取。接種塊應(yīng)盡量小些，以減少雜菌感染機(jī)會(huì)，提離菌種的純度。接種塊移到培養(yǎng)基上，就應(yīng)該放到適合菌絲生長(zhǎng)的22℃～26℃的溫室或溫箱中培養(yǎng)，使菌絲恢復(fù)生長(zhǎng)。
（2）土中菌絲分離：食用菌種類很多，許多土生的食用菌；孢子不易萌發(fā)。組織分離也不易成功，用土中菌絲分離獲得純種的方法，叫土中菌絲分離。
土中菌絲分離時(shí)要注意，由于土中菌絲體的周圍生活著多種多樣的土壤微生物，因此分離時(shí)必須盡可能避開(kāi)這些微生物的干擾，盡可能批取清潔菌絲素的尖端、不帶雜物的菌絲接種，反復(fù)用無(wú)菌水沖洗，在培養(yǎng)基中加入一些抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物，如40微克／升的鏈霉素或金霉素。如發(fā)現(xiàn)感染細(xì)菌，可以把菌落邊緣的菌絲挑出來(lái)，接種到木屑培養(yǎng)基中。因細(xì)菌沒(méi)有分解木質(zhì)素的能力，因此在木屑培養(yǎng)基中不易擴(kuò)展；只局限于接種處。待菌絲長(zhǎng)出感染區(qū)后，就可以再進(jìn)行擴(kuò)大提純了。
（3）子實(shí)體基部分離：從瓶栽、袋栽或大床栽培的子實(shí)體基部分離出新菌絲的方法，叫子實(shí)體基部分離，現(xiàn)以袋栽銀耳為例說(shuō)明：
從出耳早、出耳率離、無(wú)病蟲(chóng)害的栽培室中；選擇生活力最強(qiáng)的幼耳5袋，移到氣候溫和，有散射光的野外場(chǎng)所進(jìn)行后期培養(yǎng)，以增強(qiáng)菌絲體的生活力。經(jīng)培養(yǎng)7～10天后，待子實(shí)體直徑達(dá)4～5厘米時(shí)便可取回，作為分離的母體。再?gòu)闹泻Y選最理想的一朵，用利刀割掉銀耳子實(shí)體，放置于0℃的冰箱或有敵敵畏的容器中過(guò)夜，以便殺死瓶中的害蟲(chóng)。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外邊的雜質(zhì)，連同接種工具、接種培養(yǎng)基等移進(jìn)無(wú)菌室。經(jīng)滅菌后，用接種刀把袋口上部約15毫米厚的老菌根挖除，并進(jìn)行培養(yǎng)。待袋口露出白色菌絲時(shí)，用接種針挑取一塊半粒米大的白色菌結(jié)體，迅速移入母種試管培養(yǎng)基的中央，輕輕地脫去接種針，塞上棉塞。
為了能夠獲得較多的母種，一次接種量要有100—200支試管，以便從中選擇。分離后應(yīng)及時(shí)移入22℃—24℃恒溫箱或溫室中培養(yǎng)。由于培養(yǎng)基內(nèi)水分較多，菌絲恢復(fù)要比耳木分離得快。經(jīng)2-3天后，分離物的邊緣就可看到白色菌絲。每天要至少觀察兩次，以便提純。觀察、提純方法與耳木分離法擔(dān)同。經(jīng)適溫培養(yǎng)10-15天后，當(dāng)接種塊扭結(jié)團(tuán)出現(xiàn)紅、黃色水珠時(shí)，即可擴(kuò)大原種。