百歐博偉生物提醒您在細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中一定要注意以下幾點(diǎn)！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2018-12-06 09:13:37
1、不要在細(xì)胞狀態(tài)不好時，進(jìn)行細(xì)胞凍存。如，長的太過了，培養(yǎng)液已經(jīng)很黃了；細(xì)胞可疑污染；細(xì)胞已經(jīng)開始凋亡或崩解；連續(xù)培養(yǎng)超過二個月，細(xì)胞性狀已有改變。應(yīng)該在增殖旺盛，情況穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)效果良好，復(fù)蘇后兩周內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞凍存。
2、凍存時細(xì)胞濃度低于1-5 ×106個/ml，很難復(fù)蘇成功，應(yīng)該離心后調(diào)整細(xì)胞濃度。
3、一定要選擇原配的管子和蓋子（不同牌子/型號的顏色會有差別），凍存管的蓋子一定要擰緊，否則復(fù)蘇水浴時會滲水，造成污染。
4、盡量選擇程序冷凍盒進(jìn)行細(xì)胞凍存。如果沒有，應(yīng)選擇厚壁泡沫塑料盒，或塞入大量干棉花。防止放在-80℃的凍存盒，壁太薄，細(xì)胞被迅速降溫。確?！熬徑怠?。
5、凍存的細(xì)胞應(yīng)盡快轉(zhuǎn)入液氮，不要在-80℃冰箱放置超過一個月。
6、防止找不到或拿錯細(xì)胞，每只凍存管都應(yīng)標(biāo)上細(xì)胞的名稱，凍存時間，并記錄在冊。
7、取細(xì)胞時應(yīng)做好防護(hù)措施，帶好防凍手套，護(hù)目鏡。細(xì)胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。
8、必須在1-2min內(nèi)使凍存液完全融化，復(fù)蘇溫度太慢，會造成細(xì)胞的損傷。如果凍存管的壁較厚，隔熱效果較好，可以適當(dāng)提高水浴溫度（37℃~40℃）。二甲亞砜（DMSO）最好選擇進(jìn)口產(chǎn)品。
9、提前預(yù)定超凈臺，減少復(fù)蘇后插在冰盒里等待的時間。復(fù)蘇后長時間（1h），還沒有加入新的培養(yǎng)液。高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時保護(hù)細(xì)胞，但復(fù)蘇溶解后，浸泡時間太久會對細(xì)胞有毒性。
10、關(guān)于細(xì)胞溶解后，是否需要離心的問題，需要根據(jù)特定的細(xì)胞情況而定。主要有兩種方式。一種是解凍后的細(xì)胞懸液直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，第二天換液（后貼壁后即換液）。因?yàn)殡x心的目的是兩個，去除DMSO，去除死細(xì)胞，這個是標(biāo)準(zhǔn)流程。但對一般人來說，把握不好離心轉(zhuǎn)速和時間，轉(zhuǎn)的不夠活細(xì)胞沉底的少，細(xì)胞就全被扔掉了，轉(zhuǎn)過了活細(xì)胞會受壓過大，死亡。此外在操作過程中容易污染。另一種是須離心后，將凍存液倒干凈，且一定要倒干凈。
11、對于不離心直接加入培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，培養(yǎng)基的加入量是個需要考慮的問題。主要涉及DMSO的濃度，如果你加入培養(yǎng)基太少，DMSO的濃度就會比較大，影響細(xì)胞生長。而加入培養(yǎng)基太多，又會影響細(xì)胞的貼壁效果。
12、DMSO的濃度在小于5%（也有說1%）的時候?qū)σ话慵?xì)胞沒有什么影響。所以如果你的凍存液的濃度是10%DMSO，那么1ml的細(xì)胞加入10ml以上的培養(yǎng)基就恰好稀釋到了無害濃度。
13、有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。不要復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒有任何動靜，認(rèn)為失敗，倒掉所有細(xì)胞。
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