中國微生物菌種查詢網(wǎng)細胞中的蛋白質(zhì)通過合成和降解等活動控制處于恒定狀態(tài)。為了使細胞更高效，減少不必要的蛋白質(zhì)負荷，細胞中的大多數(shù)蛋白質(zhì)都有一個明確定義的半衰期。細胞進化到降解蛋白質(zhì)的另一個原因是，確保及時清除已經(jīng)完成工作的蛋白質(zhì)(如細胞周期蛋白)，避免由于某些蛋白質(zhì)的構(gòu)成作用而可能發(fā)生的不良影響(如放松管制在細胞周期蛋白的蛋白酶體降解會加速不受控制的癌細胞的擴散)。接下來就和小編一起研究如何測定蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性？
一、脈沖追蹤
這是一種追蹤蛋白質(zhì)并估計其穩(wěn)定性的傳統(tǒng)方法，除了涉及到處理放射性，這種方法在測量蛋白質(zhì)半衰期時比其他藥理方法具有明顯的優(yōu)勢，在實驗室中仍然經(jīng)常使用。它不僅能測量蛋白質(zhì)半衰期，而且如果你擅長放射自顯影和亞細胞分離，還可以追蹤蛋白質(zhì)并確定其亞細胞定位。
實驗涉及在短時間內(nèi)用放射性前體標記細胞(脈沖，通常是在培養(yǎng)基中添加放射性的甲硫氨酸和/或半胱氨酸)，然后在蛋白質(zhì)動力學過程中，在培養(yǎng)基中添加未標記的前體，細胞被允許恢復。隨著帶有標記前體的舊蛋白在細胞內(nèi)被降解，使用未標記前體的新蛋白同時被合成。在不同的時間點免疫沉淀蛋白質(zhì)，用放射自顯影法測量樣品中的放射性。根據(jù)非放射性蛋白質(zhì)取代放射性蛋白質(zhì)的速度，可以確定任何蛋白質(zhì)的半衰期。這種方法的另一種非放射性變異是最近流行的bleach-chase(漂白追蹤)，具體方法是目的蛋白與熒光團融合，進而通過短暫的光脈沖來漂白，漂白促使標記蛋白分為了兩種亞群：熒光蛋白和非熒光蛋白，漂白后熒光恢復率與降解速率相關(guān)。
二、環(huán)己酰亞胺追蹤
這是一種更簡單的方法來替代脈沖追蹤和避免放射性的使用。通常，這種方法通過添加環(huán)己酰亞胺來抑制蛋白質(zhì)的合成，然后評估目的蛋白隨時間的降解情況。環(huán)己酰亞胺是一種新的蛋白質(zhì)合成抑制劑，通過與60S核糖體單位的E -位點結(jié)合，抑制翻譯的延伸。而這反過來又會抑制蛋白質(zhì)的合成，使研究人員不必擔心正在進行的蛋白質(zhì)合成的影響，就能跟蹤蛋白質(zhì)的降解情況。加入環(huán)己酰亞胺將蛋白質(zhì)合成排除在外，使研究人員能夠?qū)ｉT研究蛋白質(zhì)降解隨時間的變化。
三、降解途徑的藥理學抑制劑
細胞內(nèi)有兩種主要降解途徑：蛋白酶體途徑和溶酶體途徑。有一些特定的藥理學抑制劑可用于評估這兩種途徑的降解。蛋白酶體途徑通過一系列酶將蛋白質(zhì)用泛素標記，這種泛素標記的蛋白質(zhì)最終定向到細胞蛋白酶體復合物，并在此被降解。但在某些情況下，蛋白酶體降解可能獨立于泛素化而發(fā)生，在對可能的降解途徑的假設進行測試時，這一點不能忽視。更復雜的是，泛素化可能也會在溶酶體降解途徑中發(fā)揮作用。溶酶體降解也被分為許多不同的類型，基于實際的降解細胞機制的細微差別(大自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬)。
為了評估目的蛋白是否通過蛋白酶體途徑降解，可以通過藥物抑制蛋白酶體復合物，并評估這種干預對目的蛋白表達的影響。研究人員通常使用蛋白酶體抑制劑如MG-132，Epoxomicin和硼替佐米，這些抑制劑與蛋白酶體復合物中特定的蛋白水解位點結(jié)合并阻止蛋白質(zhì)的降解。還有一種藥理學抑制劑和遺傳策略研究自噬降解，這是一個值得單獨討論的話題。用于研究這種降解方式的抑制劑如氯喹和BafimlmycinA1，通過中和溶酶體中的酸性pH值來發(fā)揮作用，而這是溶酶體蛋白酶作用的必需條件。然后建立相關(guān)的劑量和持續(xù)時間，同時檢查細胞的生存能力，以確保使用這些藥物治療細胞，但不會殺死細胞。
四、降解相關(guān)的翻譯后修飾
確定了目的蛋白的降解路徑，就可以分析哪些標簽(翻譯后修飾，PTM)是這個過程必須的。有許多類型的PTMs可以標記蛋白質(zhì)降解，也有特定的降解基序(降解決定子)，靶向蛋白質(zhì)降解途徑。一些常見的降解決定子如D-boxes，PEST, and KEN boxes，可以幫助蛋白質(zhì)標記，并通過各種機制促進蛋白質(zhì)的降解。一些降解決定子能使蛋白更易接近E3連接酶，E3連接酶可以將其帶到蛋白酶體復合物中。
在開始對蛋白質(zhì)進行突變分析之前，檢查蛋白質(zhì)的一級氨基酸序列，以確定是否有任何特定的降解決定子。如果文獻中沒有降解相關(guān)PTMs的優(yōu)先級，有一些特定的數(shù)據(jù)庫可以快速檢查，如PhosphoSite (磷酸化和其他PTMs)和mUbiSiDa(泛素化)。
在縮小你認為與降解相關(guān)的殘留物后，下一步是改變這些殘留物，并評估這些突變對目的蛋白穩(wěn)定性的影響。例如，在降解相關(guān)的位點上，一個賴氨酸突變?yōu)榫彼?，可以去除泛素連接所必需的epsilon氨基，并能穩(wěn)定蛋白質(zhì)。類似地，如果認為磷酸化對降解是關(guān)鍵的，那么磷酸缺陷的(如絲氨酸到丙氨酸)和磷酸模擬突變(如絲氨酸到谷氨酸)可以改變目的蛋白的降解曲線。
五、分析蛋白質(zhì)的泛素化動力學
蛋白酶體降解往往先于泛素化。檢測泛素化可以提供一個強有力的數(shù)據(jù)，證實目的蛋白很有可能成為蛋白酶體的靶點。比如拉下目的蛋白，然后使用抗泛素蛋白抗體來評估其泛素化狀態(tài)。當IP樣本被抗泛素抗體檢測時，你通常希望看到的是一個涂片或梯形條帶效應。這是因為不同的更高修飾形式的蛋白質(zhì)被識別，因為它們逐步被多個泛素分子標記。在蛋白酶體阻滯后，檢測到的泛素涂片的強度可能會變深——表明多泛素化蛋白的積聚。泛素化蛋白是出了名的不穩(wěn)定，并且收集細胞的具體實驗條件和時間必須經(jīng)過仔細的優(yōu)化，以防止在樣本準備過程中泛素化的丟失。因為在許多情況下，基于抗體的方法可能由于非特定的下拉。一種更好更清潔的方法是將目的蛋白標記his標簽，并利用鎳柱親和拉下，評估蛋白質(zhì)的泛素化。另一個好的控制方法是使用HA標記的泛素質(zhì)粒，并在下拉之前將其與目的蛋白共轉(zhuǎn)染。去除這些質(zhì)粒中的一種或兩種，應該減少或甚至消除泛素化。