1 范圍
本方法適用于飲料中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。
2 原理
飲料樣品處理后，經(jīng)增菌及分離，采用血漿凝固酶試驗(yàn)判定結(jié)果并計(jì)數(shù)。
3 試劑
3.1 胰酪胨大豆肉湯
3.1.1 成分
胰酪胨(或胰蛋白胨) 17g
植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3g
氯化鈉 100g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸餾水 1000mL
3.1.2 制法
將上述成分混合，加熱并輕輕攪拌至完全溶解，分裝后，于 121℃下高壓滅菌 15min，溶液的最終 pH 為 7.3±0.2。3.2 7.5%氯化鈉肉湯
3.2.1 成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化鈉 75g
蒸餾水 1000mL
3.2.2 制法
將上述成分加熱溶解，校正 pH 為 7.4，分裝試管，于 121℃下高壓滅菌 15min。
3.3 血瓊脂平板
3.3.1 成分
pH 7.4～7.6 豆粉瓊脂 100mL
脫纖維羊血(或兔血) 5～10mL
3.3.2 制法
加熱溶化瓊脂，冷至 50℃，以滅菌手續(xù)加入脫纖維羊血，混勻，傾注平板。亦可分裝滅菌試管，置成斜面。亦可用其他營養(yǎng)豐富的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制血瓊脂。
3.4 Baird-Parker 瓊脂平板
3.4.1 成分
胰蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
酵母膏 1g
丙酮酸鈉 10g
甘氨酸 12g
氯化鋰(LiCl·6H2O) 5g
瓊脂 20g
蒸餾水 950mL
3.4.2 增菌劑的配法
30%卵黃鹽水 50mL 與除菌過濾的 1%亞碲酸鉀溶液 10mL 混合，保存于冰箱內(nèi)。
3.4.3 制法
將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解。冷至 25℃，校正 pH 為 7.5。分裝每瓶95mL，于 121℃下高壓滅菌 15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至 50℃，每 95mL 加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5mL，混勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過 48h。
3.5 肉浸液肉湯
3.5.1 成分
絞碎牛肉 500g
氯化鈉 5g
蛋白胨 10g
磷酸氫二鉀 2g
蒸餾水 1 000mL
3.5.2 制法
將絞碎之去筋膜無油脂牛肉 500g 加蒸餾水 1000mL，混合后放冰箱過夜，除去液面之浮油，隔水煮沸半小時(shí)，使肉渣完全凝結(jié)成塊，用絨布過濾，并擠壓收集全部濾液，加水補(bǔ)足原量。加入蛋白胨、氯化鈉和磷酸鹽，溶解后校正 pH 為 7.4～7.6 煮沸并過濾，分裝燒瓶，于 121℃下高壓滅菌 30min。
3.6 滅菌鹽水
3.7 兔血漿
3.7.1 成分
檸檬酸鈉 3.8g
蒸餾水 100mL
兔血 全血
3.7.2 制法
取檸檬酸鈉 3.8g，加蒸餾水到 100mL，溶解后過濾，裝瓶，121℃高壓滅菌 15min。取3.8%檸檬酸鈉溶液一份加兔全血四份，混好靜置之，則血球下降，即可得血漿進(jìn)行試驗(yàn)。
4 設(shè)備和材料
4.1 顯微鏡
4.2 恒溫箱，36±1℃
4.3 離心機(jī)
4.4 滅菌吸管，1 mL、10 mL
4.5 滅菌試管
4.6 滅菌平皿
4.7 均質(zhì)器
4.8 載玻片
4.9 L型涂布棒
4.10 酒精燈
4.11 接種環(huán)
5 操作步驟
5.1 增菌培養(yǎng)法
5.1.1 檢樣處理
固體樣品稱取25 g；液體樣品吸取25 mL，加入225 mL滅菌生理鹽水，混勻。
5.1.2 增菌及分離培養(yǎng)
吸取5 mL上述混懸液，接種于7.5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯50 mL培養(yǎng)基內(nèi)，置363±1℃溫箱培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)種血平板和Baird-Parker平板，36±1℃培養(yǎng)24 h，挑取金黃色葡萄球菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。
5.1.3 形態(tài)
本菌為革蘭氏陽性球菌，排列是葡萄球狀，無芽胞，無莢膜，致病性葡萄球菌菌體較小，
直徑約為0.5～1?m。
5.1.4 在肉湯中呈混濁生長，在胰酪胨大豆肉湯內(nèi)有時(shí)液體澄清，菌量多時(shí)呈混濁生長，血
平板上菌落呈金黃色，也有時(shí)為白色，大而突起、圓形、不透明、表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2～3 mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。
5.1.5 血漿凝固酶試驗(yàn)
吸取1：4新鮮兔血漿0.5 mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌浸液肉湯培養(yǎng)物0.5 mL，振蕩搖勻，放36±1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6 h，如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性結(jié)果。同時(shí)以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對(duì)照。
5.2 直接計(jì)數(shù)方法
5.2.1 吸取上述1：10混懸液，進(jìn)行十倍遞次稀釋，根據(jù)樣品污染情況，選擇不同濃度的稀釋液1 mL，分別加入三塊Baird-Parker平板，每個(gè)平板接種量分別為0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL，然后用滅菌L棒涂布整個(gè)平板。如水分不多吸收，可將平板放在36±1℃溫箱1 h，等水分蒸發(fā)后反轉(zhuǎn)平皿置36±1℃溫箱培養(yǎng)。
5.2.2 在三個(gè)平板上點(diǎn)數(shù)周圍有混濁帶的黑色菌落，并從中任選5個(gè)菌落，分別接種血平板，36±1℃24 h培養(yǎng)后進(jìn)行染色鏡檢、血漿凝固酶試驗(yàn)，步驟同增菌培養(yǎng)法。
5.2.3 菌落計(jì)數(shù)：將三個(gè)平板中疑似金黃色葡萄球菌黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以 5，再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。
6 參考文獻(xiàn)
GB 4789.10— 1994 “食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)”。