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1 范圍
本方法適用于飲料中志賀氏菌的檢驗(yàn)。
2 原理
飲料樣品處理后，經(jīng)增菌、分離、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)及血清學(xué)鑒定判定志賀氏菌型，報(bào)告結(jié)果。
3 試劑
3.1 GN增菌液
3.1.1 成分
胰蛋白胨 20g
葡萄糖 1g
甘露醇 2 g
檸檬酸鈉 5g
去氧膽酸鈉 0.5g
磷酸氫二鉀 4 g
磷酸二氫鉀 1.5g
氯化鈉 5 g
蒸餾水 1000mL
3.1.2 制法
按上述成分配好，加熱使溶解，校正pH7.0。分裝每瓶225mL，115℃高壓滅菌15min。
3.2 HE 瓊脂
3.2.1 成分
月示胨 12g
牛肉膏 3g
乳糖 12g
蔗糖 12g
水楊素 2g
膽鹽 20g
氯化鈉 5g
瓊脂 18～20g
蒸餾水 1000mL
0.4％ 溴麝香草酚藍(lán)溶液 16mL
Andrade 指示劑 20mL
甲 液 20mL
乙液 20mL
3.2.2 制法
將前面七種成分溶解于 400mL 蒸餾水內(nèi)作為基礎(chǔ)液，將瓊脂加入于 600mL 蒸餾水內(nèi)，加熱溶解。加入甲液和乙液于基礎(chǔ)液內(nèi)，校正 pH7.5。再加入指示劑，并與瓊脂液合并，待冷至 50～55℃，傾注平板。
注：①此培養(yǎng)基不可高壓滅菌。
②甲液的配制
硫代硫酸鈉 34g
檸檬酸鐵銨 4g
蒸餾水 100mL
③乙液的配制
去氧膽酸鈉 10g
蒸餾水 100mL
④Andrade 指示劑的配制
酸性復(fù)紅 0.5g
1mol/L 氫氧化鈉溶液 16mL
蒸餾水 100mL
將復(fù)紅溶解于蒸餾水中，加入氫氧化鈉溶液。數(shù)小時(shí)后如復(fù)紅褪色不全，再加氫氧化鈉溶液 1～2mL。
3.3 SS 瓊脂
3.3.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基
牛肉膏 5g
月示胨 5g
三號(hào)膽鹽 3.5g
瓊脂 17g
蒸餾水 1000mL
將牛肉膏、月示胨和膽鹽溶解于400mL蒸餾水中，將瓊脂加入于600mL蒸餾水中，煮沸使其溶解，再將兩液混合，121℃高壓滅菌15min，保存?zhèn)溆谩?br />
3.3.2 完全培養(yǎng)基
基礎(chǔ)培養(yǎng)基 1000mL
乳糖 10g
檸檬酸鈉 8.5g
硫代硫酸鈉 8.5g
10％檸檬酸鐵溶液 10mL
1％中性紅溶液 2.5mL
0.1％煌綠溶液 0.33mL
加熱溶化基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均勻 ，校正至 pH7.0，加入中性紅和煌綠溶液 ，傾注平板。
注；①制好的培養(yǎng)基宜當(dāng)日使用 ，或保存于冰箱內(nèi)于 48h 內(nèi)使用。
②煌綠溶液配好后應(yīng)在 10d 以內(nèi)使用。
③可以購(gòu)用 SS 瓊脂的干燥培養(yǎng)基。
3.4 麥康凱瓊脂
3.4.1 成分
蛋白胨 17g
月示胨 3g
豬膽鹽(或牛、羊膽鹽) 5g
氯化鈉 5g
瓊脂 17g
蒸餾水 1000mL
乳糖 10g
0.1％ 結(jié)晶紫水溶液 10mL
0.5％ 中性紅水溶液 5mL
3.4.2 制法
將蛋白胨、月示胨、膽鹽和氯化鈉溶解于 400mL 蒸餾水中，校正 pH7.2。將瓊脂加入 600mL 蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌 15min
備用。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至 50～55℃時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。
注：結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。
3.5 伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）
3.5.1 成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氫二鉀 2g
瓊脂 17g
2％伊紅 Y 溶液 20mL
0.65％ 美藍(lán)溶液 10mL
蒸餾水 1000mL
3.5.2 制法
將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正pH7.1，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶化瓊脂，冷至50～55℃，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻，傾注平板。
3.6 三糖鐵瓊脂（TSI）
3.6.1 成分
蛋白胨 20g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化鈉 5g
硫酸亞鐵銨 〔Fe(NH4 )2 (SO4 )2 ?6H2O〕 0.2g
硫代硫酸鈉 0.2g
瓊脂 12g
酚紅 0.025g
蒸餾水 1000mL
3.6.2 制法
將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于水中，校正pH7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121℃高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆谩?br />
3.7 三糖鐵瓊脂（換用方法）
3.7.1 成分
蛋白胨 15g
月示胨 5g
牛肉膏 3g
酵母膏 3g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化鈉 5g
硫酸亞鐵 0.2g
硫代硫酸鈉 0.3g
瓊脂 12g
酚紅 0.025g
蒸餾水 1000mL
3.7.2 制法
將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于水中，校正pH7.4。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121℃高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆谩?br />
3.8 葡萄糖半固體管
3.8.1 成分
蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g
氯化鈉 0.5g
葡萄糖 1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 0.1mL
瓊脂 0.3g
蒸餾水 100mL
3.8.2 制法
將蛋白胨、牛肉膏和氯化鈉加入于水中，校正pH7.4后加入瓊脂加熱溶解，再加入指示劑和葡萄糖，分裝小試管，滅菌121℃ 15min。
3.9 半固體管
3.9.1 成分
蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g
氯化鈉 0.5g
瓊脂 0.35～0.4g
蒸餾水 100mL
3.9.2 制法
按以上成分配好，煮沸使溶解，并校正pH7.4。分裝小試管。121℃高壓滅菌15min。直立凝固備用。
3.10 葡萄糖銨瓊脂
3.10.1 成分
氯化鈉 5g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氫銨 1g
磷酸氫二鉀 1g
葡萄糖 2g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000mL
0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液 40mL
3.10.2 制法
先將鹽類和糖溶解于水內(nèi)，校正 pH6.8，再加瓊脂，加熱溶化，然后加入指示劑，混合均勻后分裝試管，121℃高壓滅菌 15min，放成斜面。
3.11 尿素瓊脂（pH7.2）
3.11.1 成分
蛋白胨 1g
氯化鈉 5g
葡萄糖 1g
磷酸二氫鉀 2g
0.4%酚紅溶液 3mL
瓊脂 20g
蒸餾水 1000mL
20％尿素溶液 100mL
3.11.2 制法
將除尿素和瓊脂以外的成分配好，并校正 pH7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化并分裝燒瓶。121℃高壓滅菌 15min。冷至 50～55℃，加入經(jīng)除菌過(guò)濾的尿素溶液。尿素的最終濃度為 2％，最終 pH 應(yīng)為 7.2±0.1。分裝于滅菌試管內(nèi)，放成斜面?zhèn)溆谩?br />
3.11.3 試驗(yàn)方法
挑取瓊脂培養(yǎng)物接種，在 36±1℃培養(yǎng) 24h，觀察結(jié)果。尿素酶陽(yáng)性者由于產(chǎn)堿而使培養(yǎng)基變?yōu)榧t色。
3.12 西蒙氏檸檬酸鹽瓊脂
3.12.1 成分
氯化鈉 5g
硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 0.2g
磷酸二氫銨 lg
磷酸氫二鉀 lg
檸檬酸鈉 5g
瓊脂 20g
蒸餾水 1000mL
0.2％溴麝香草酚藍(lán)溶液 40mL
3.12.2 制法
先將鹽類溶解于水內(nèi)，校正 pH6.8，再加瓊脂，加熱溶化。然后加入指示劑，混合均勻后分裝試管，121℃高壓滅菌 15min。放成斜面。
3.13 氰化鉀（KCN）培養(yǎng)基
3.13.1 成分
蛋白胨 10g
氯化鈉 5g
磷酸二氫鉀 0.225g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 5.64g
蒸餾水 1000mL
0.5％氰化鉀溶液 20mL
pH7.6
3.13.2 制法
將除氰化鉀以外的成分配好后分裝燒瓶，121℃高壓滅菌 15min。放在冰箱內(nèi)使其充分冷卻。每 100mL 培養(yǎng)基加入 0.5％氰化鉀溶液 2.0mL(最后濃度為 1︰10 000)，分裝于 12mm～100mm 滅菌試管，每管約 4mL，立刻用滅菌橡皮塞塞緊，放在 4 C 冰箱內(nèi)，至少可保存兩個(gè)月。同時(shí)，將不加氰化鉀的培養(yǎng)基作為對(duì)照培養(yǎng)基，分裝試管備用。
注：氰化鉀是劇毒藥物，使用時(shí)應(yīng)小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養(yǎng)基應(yīng)在冰箱內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)失敗的主要原因是封口不嚴(yán)，氰化鉀逐漸分解，產(chǎn)生氫氰酸氣體逸出，
以致藥物濃度降低，細(xì)菌生長(zhǎng)，因而造成假陽(yáng)性反應(yīng)。試驗(yàn)時(shí)對(duì)每一環(huán)節(jié)都要特別注意。
3.14 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：賴氨酸、鳥氨酸及對(duì)照培養(yǎng)基
3.14.1 成分
蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
蒸餾水 1000mL
1.6％溴甲酚紫—乙醇溶液 1mL
L-氨基酸或 DL-氨基酸 0.5 或 lg/100mL
3.14.2 制法
除氨基酸以外的成分加熱溶解后，分裝每瓶 100mL，分別加入各種氨基酸：賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。L-氨基酸按 0.5％加入，DL-氨基酸按 1％加入。再行校正 pH至 6.8。對(duì)照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝于滅菌的小試管內(nèi)，每管 0.5mL，上面滴加一層液體石蠟，115℃高壓滅菌 10min。
3.15 糖發(fā)酵管：棉子糖、甘露醇、甘油、七葉苷及水楊苷
3.15.1 成分
牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
氯化鈉 3 g
磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 2g
0.2％溴麝香草酚藍(lán)水溶液 12mL
蒸餾水 100mL
pH7.4
3.15.2 制法
葡萄糖發(fā)酵管按上述成分配好后，按 0.5％加入葡萄糖，分裝于有一個(gè)倒置小管的小試管內(nèi)， 121℃高壓滅菌 15min。
3.15.2.1 其他各種糖發(fā)酵管可按上述成分配好后，分裝每瓶 100mL，121℃高壓滅菌15min。另將各種糖類分別配好 10％溶液，同時(shí)高壓滅菌。將 5mL 糖溶液加入于 100mL
培養(yǎng)基內(nèi)，以無(wú)菌操作分裝小試管。
注：蔗糖不純，加熱后會(huì)自行水解者，應(yīng)采用過(guò)濾法除菌。
3.15.2.2 試驗(yàn)方法：從瓊脂斜面上挑取小量培養(yǎng)物接種，于36土1℃培養(yǎng)，一般觀察2～
3d。遲緩反應(yīng)需觀察14～30d。
3.16 5%乳糖發(fā)酵管
3.16.1 成分
蛋白胨 0.2g
氯化鈉 0.5g
乳糖 5 g
2％ 溴麝香草酚藍(lán)水溶液 1.2mL
蒸餾水 100mL
3.16.2 制法
除乳糖以外的各成分溶解于 50mL 蒸餾水內(nèi)，校正 pH7.4。將乳糖溶解于另外 50mL蒸餾水內(nèi)，分別滅菌 121℃15min，將兩液混合，以無(wú)菌操作分裝于滅菌小試管內(nèi)。
注：在此培養(yǎng)基內(nèi)，大部分乳糖遲緩發(fā)酵的細(xì)菌可于 1d 內(nèi)發(fā)酵。
3.17 蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑
3.17.1 成分
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20g
氯化鈉 5 g
蒸餾水 1000mL
pH7.4
3.17.2 制法
按上述成分配制，分裝小試管，121℃高壓滅菌 15min。
3.17.3 靛基質(zhì)試劑
3.17.3.1 柯凡克試劑：將 5g 對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于 75mL 戊醇中。然后緩慢加入濃鹽酸 25mL。
3.17.3.2 歐-波試劑：將 l g 對(duì)二甲氨基苯甲醛溶解于 95 mL95％乙醇內(nèi)。然后緩慢加入濃鹽酸 20 mL。
注：蛋白胨中應(yīng)含有豐富的色氨酸。每批蛋白胨買來(lái)后，應(yīng)先用已知菌種鑒定后方可使用。
3.18 志賀氏菌屬診斷血清。
4 設(shè)備和材料
4.1 天平
4.2 均質(zhì)器或乳缽
4.3 溫箱
4.4 顯微鏡
4.5 滅菌廣口瓶，500 mL
4.6 滅菌三角燒瓶，500 mL、250 mL
4.7 滅菌平皿，90 mm×15 mm
4.8 載玻片
4.9 酒精燈
4.10 滅菌金屬匙或玻璃棒
4.11 接種棒，鎳鉻絲
4.12 試管架、試管簍
4.13 硝酸纖維素濾膜：150 mm×50 mm，Φ0.45 mm。臨用時(shí)切成兩張，每張 70 mm×50 mm，用鉛筆劃格，每格 6 mm×6 mm。每行 10 格，分 6 行。滅菌備用。
5 操作步驟
5.1 增菌
稱取檢樣 25 g，加入裝有 225 mLGN 增菌液的 500 mL 廣口瓶?jī)?nèi)，于 36℃培養(yǎng) 6～8 h。培養(yǎng)時(shí)間視細(xì)菌生長(zhǎng)情況而定，當(dāng)培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時(shí)即應(yīng)中止培養(yǎng)。
5.2 分離和初步生化試驗(yàn)
5.2.1 取增菌液 1 環(huán)，劃線接種于 HE 瓊脂平板或 SS 瓊脂平板 1 個(gè)；另取 1 環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板或伊紅美藍(lán)瓊脂平板 1 個(gè)，于 36℃培養(yǎng) 18～24 h，志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無(wú)色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。
5.2.2 挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各 1 管。一般應(yīng)多挑幾個(gè)菌落，以防遺漏，經(jīng) 36℃培養(yǎng) 18～24 h，分別觀察結(jié)果。
5.2.3 下述培養(yǎng)物可以棄去：
a. 在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長(zhǎng)的培養(yǎng)物；
b. 在 18～24 h 內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；
c. 不分解葡萄糖和只生長(zhǎng)在半固體表面的培養(yǎng)物；
d. 產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；
e. 有動(dòng)力的培養(yǎng)物；
f. 產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物 ；
5.2.4 凡是乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（福氏志賀氏菌 6 型可產(chǎn)生少量氣體），無(wú)動(dòng)力的菌株，可做血清學(xué)分型和進(jìn)一步的生化試驗(yàn)。
5.3 血清學(xué)分型和進(jìn)一步的生化試驗(yàn)
5.3.1 血清學(xué)分型
挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。先用 4 種志賀氏菌多價(jià)血清檢查，如果由于 K 抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應(yīng)將菌液煮沸后再檢查；如果呈現(xiàn)凝集，則用 A1、A2、B
群多價(jià)和 D 群血清分別試驗(yàn)。如系 B 群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見表 1。可先用群因子血清檢查，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結(jié)果，依次選用型因子血清檢查。
4 種志賀氏菌多價(jià)血清不凝集的菌株，可用鮑氏多價(jià) 1、2、3 分別檢查，并進(jìn)一步用 1～15 各型因子血清檢查。如果鮑氏多價(jià)血清不凝集，可用痢疾志賀氏菌 3～12 型多價(jià)血清及各
型因子血清檢查。
型和亞型 型抗原 群抗原 在群因子血清中的凝集
3，4 6 7，8
1a I 1，2，4，5，9…… + － －
1b I 1，2，4，5，9…… + + －
2a Ⅱ 1，3，4…… + － －
2b Ⅱ 1，7，8，9…… － － +
3a Ⅲ 1，6，7，8，9…… － + +
3b Ⅲ 1，3，4，6…… + + －
4a Ⅳ 1，（3，4）…… （+） － －
4b Ⅳ 1，3，4，6…… + + －
5a Ⅴ 1，3，4…… + － －
5b Ⅴ 1，5，7，9…… － － +
6 Ⅵ 1，2，（4） （+） － －
X 變體 — 1，7，8，9…… － － +
Y 變體 — 1，3，4…… + － －
注：+凝集；－不凝集；（+）有或無(wú)。
5.3.2 進(jìn)一步的生化試驗(yàn)
在做血清學(xué)分型的同時(shí)，應(yīng)做進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，即：葡萄糖銨，西蒙氏檸檬酸鹽，賴
氨酸和鳥氨酸脫羥酶，pH7.2 尿素，KCN 生長(zhǎng)，以及水楊苷和七葉苷的分解。除宋內(nèi)氏菌和
鮑氏 13 型為鳥氨酸陽(yáng)性外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。必要時(shí)還應(yīng)做革蘭氏染色檢
查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某
種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物。
已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)一步做 5%乳糖發(fā)酵，甘露醇、棉子糖和甘油的發(fā)酵
和靛基質(zhì)試驗(yàn)。志賀氏菌屬 4 個(gè)生化群的培養(yǎng)物，應(yīng)符合該群的生化特性。但福氏 6 型的生
化特性與 A 群或 C 群相似，見表 2。
表 2 志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特性
生化群 5%乳糖 甘露醇 棉子糖 甘油 靛基質(zhì)
A 群：痢疾志賀氏菌 － － － （+） －/+
B 群：福氏志賀氏菌 － + + － （+）
C 群：鮑氏志賀氏菌 － + － （+） －/+
D 群：宋內(nèi)氏志賀氏菌 +/（+） + + d －
注：+陽(yáng)性；－陰性；－/+多數(shù)陰性，少數(shù)陽(yáng)性；（+）遲緩陽(yáng)性；d 有不同生化型。
5.4 結(jié)果報(bào)告：綜合生化和血清學(xué)的試驗(yàn)結(jié)果判定菌型并作出報(bào)告。
6 參考文獻(xiàn)
GB 4789.5—1994 “食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)”。