食品中黃曲霉毒素B1檢測方法研究
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-03-07 09:13:09
黃曲霉毒素(AF)主要成分是由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)產(chǎn)生的有毒性的次生代謝產(chǎn)物，屬于真菌毒素，廣泛存在于自然界中。黃曲霉毒素由大約18種化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的衍生物組成，包括B和G兩大類，植物性食物中產(chǎn)生B1、B2、G1和G2，而乳或乳制品(包括乳酪、奶粉等)中產(chǎn)生M1、M2。黃曲霉毒素B1在植物性食物衍生組中毒性最強(qiáng)，其慢性毒性甚至可誘發(fā)肝癌。
AF需要在機(jī)體內(nèi)代謝活化才能表現(xiàn)出毒性。首先，細(xì)胞內(nèi)的多功能氧化酶將AF催化成環(huán)氧化物;然后，環(huán)氧化物與大分子反應(yīng)生成DNA、RNA、蛋白質(zhì)和類脂的結(jié)合物，并表現(xiàn)出兩種毒性——急性毒性和慢性毒性，分別表現(xiàn)為AF與蛋白質(zhì)(包括酶)、類脂的反應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞的死亡，與核酸的反應(yīng)可導(dǎo)致突變。研究表明，在所有真菌毒素中，AFB1的毒性、致癌性最大——能阻止蛋白、酶和凝血因子合成，又能抑制葡萄糖、脂肪酸、代謝產(chǎn)物的合成，從而導(dǎo)致免疫抑制、脂肪退化和DNA損傷。
AFB1在動物體中的急性毒性如表1所示，其毒性因動物年齡、種類、性別而異。一般來說，幼年動物對AFB1的敏感性要大于成年動物，雄性動物的敏感性要大于雌性動物。研究表明，當(dāng)豬飼料中AFB1的含量達(dá)到810ppm時，飼料的轉(zhuǎn)化率下降，豬的體重也明顯下降，甚至?xí)霈F(xiàn)死亡，解剖發(fā)現(xiàn)其肝臟出現(xiàn)退行性變化，肝細(xì)胞大面積壞死。AF除了會對大鼠引起肝癌外，還會使大鼠患上胃癌、結(jié)腸癌和腎臟上皮癌。
人體攝入被AF污染的食物后經(jīng)消化道吸收，其大部分積累在肝臟，少部分分布在腎臟、血液和肌肉中，在機(jī)體內(nèi)通過羥基化、去甲基化和環(huán)氧化等作用形成代謝產(chǎn)物使機(jī)體致癌、致突變。研究表明，AF的LD50(半數(shù)動物致死量)為0.249mg/kg，毒性比氰化鉀高10倍。AFB1在人體內(nèi)的危害表現(xiàn)為急性毒性和慢性毒性，急性毒性在人體內(nèi)會出現(xiàn)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死、膽管上皮細(xì)胞增生、肝脂肪浸潤及肝出血等[8]，前期癥狀為發(fā)燒、嘔吐、黃疸，繼而出現(xiàn)腹水和下肢浮腫，最終可導(dǎo)致死亡。AFB1是一種能導(dǎo)致人體遺傳物質(zhì)發(fā)生變化的致突變化合物，其在人體的代謝產(chǎn)物有致突變作用，包括AFB1-2,3-環(huán)氧化物、AFM1和AFP1等，其中AFB1-2,3-環(huán)氧化物的第2個碳與DNA的鳥嘌呤酮基結(jié)合形成AFB1-DNA加合物，去嘌呤反應(yīng)通過形成AFB1-N7-鳥嘌呤，使DNA分子產(chǎn)生無嘌呤位置的缺口，從而造成DNA損傷，進(jìn)而可能導(dǎo)致癌變。致癌性表現(xiàn)為AFB1可引起細(xì)胞錯誤地修復(fù)DNA，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的DNA誘變，并進(jìn)一步抑制DNA和RNA的合成，最終抑制蛋白質(zhì)的合成及基因變化積累。目前，科學(xué)家已證實(shí)p53基因是癌癥的抑制基因，很多人可能在幼年時就受到AFB1的攻擊，加之人體內(nèi)特定基因的缺失或變異引起p53基因突變，最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生癌變。
由于AFB1具有危害性和廣泛性，人們需要有效的檢測方法測定其在食品中的含量，確保對人和家畜的傷害降到最低。目前檢測AFB1的方法很多，但主要分為三大類：化學(xué)分析法、生物鑒定法、儀器分析法，其中有4種方法的運(yùn)用較為廣泛，即TLC(薄層層析)、HPLC(高效液相色譜)、GICA(膠體金標(biāo)免疫層析分析法)、ELISA(酶聯(lián)免疫法)。
2 食品中AFB1的幾種檢測方法
2.1 薄層層析法(TLC)
AF是低分子量極性化合物，它的特點(diǎn)是可以吸收紫外光，利用這一特點(diǎn)衍生了多種測定AF的方法，而薄層層析方法是最早被運(yùn)用的方法。薄層層析法(TLC)同時具有定性和定量的分析功能，所以被美國官方確定為標(biāo)準(zhǔn)方法，我國也在國家標(biāo)準(zhǔn)中將其確立為仲裁法。TLC的原理是利用AFB1在365nm紫外波長下會發(fā)出藍(lán)色熒光的特點(diǎn)，再經(jīng)過固相層分離后，對其熒光的強(qiáng)度進(jìn)行測定，并且與標(biāo)準(zhǔn)液相比，最終得出結(jié)果。這種方法不需要專門的儀器設(shè)備，成本低，實(shí)驗(yàn)室大都能完成對AF的測定。但是，最原始的薄層分析由于分辨率不穩(wěn)定，受周圍因素的影響很大，檢測結(jié)果不穩(wěn)定，差異性較大。同時，該方法的工作量比較復(fù)雜，耗費(fèi)時間較長，且在做定量分析時精確度較低?，F(xiàn)如今，隨著科技的迅速發(fā)展，出現(xiàn)了很多固相吸附材料，可以使薄層層析的準(zhǔn)確度得到提升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量。張慧麗等通過用黃曲霉菌株接種18種花生仁，利用半定量薄層層析法和精確定量高效液相色譜法檢測到的AF質(zhì)量濃度確定花生的抗AF合成的能力，鑒定出2個高抗黃曲霉感染和AF質(zhì)量濃度低的花生品種。
2.2 高效液相色譜(HPLC)
1986年，AOAC International首次將高效液相色譜法(HPLC)作為檢測乳液中AFM1及AFM2公認(rèn)的方法，也是國內(nèi)外研究機(jī)構(gòu)認(rèn)為檢測AF最權(quán)威的一種方法，其具有分析自動化的潛力，且具備靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn)。但是，HPLC對樣品的純度要求很高，必要時需將原料進(jìn)行衍生才能使用這種方法。經(jīng)長期研究實(shí)踐，研究人員總結(jié)出一些使用該方法的技巧。AF的熒光特性受流動相中的液體影響較大，只能檢測到1~2種AF，有的甚至?xí)l(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，所以在測定時要同時運(yùn)用紫外檢測器和熒光檢測器才能將試樣中的AF檢測完全。此外，國內(nèi)外學(xué)者也對高效液相色譜法測定AF進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。陸勤佳等人基于高效液相色譜熒光法設(shè)計(jì)并完成了一套由分離系統(tǒng)、恒溫控制系統(tǒng)、熒光檢測器、主控板和人機(jī)交互界面組成的AF檢測系統(tǒng)，并且經(jīng)過測試，表明該AF檢測系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性——結(jié)構(gòu)緊湊、檢測速度快且靈敏度高，能用于AF的實(shí)際檢測。王勇建立AFB1的柱前衍生-高效液相色譜(HPLC)檢測方法，該方法具有良好的準(zhǔn)確性、靈敏性和重復(fù)性，可對組織樣品中AFB1殘留量進(jìn)行快速準(zhǔn)確分析，為AFB1在食品中的快速檢測奠定基礎(chǔ)。Beaver R、Klaus R等研究發(fā)現(xiàn)，在柱后衍生時向其中加入碘，會增強(qiáng)AFB1的熒光度——是之前的25倍，該方法已經(jīng)被運(yùn)用到花生制品AFB1的含量檢測中;該方法需要使用的儀器非常昂貴，一般在進(jìn)出口檢測實(shí)驗(yàn)室使用。羅朝權(quán)等為建立一種快速檢測動物類藥材污染AFB1(AFB1)和AFG1(AFG1)的液質(zhì)聯(lián)用法，并用于水蛭等6種動物類中藥材污染情況的分析，結(jié)果表明，土鱉蟲等動物類藥材受AF污染的情況較為嚴(yán)重。
2.3 酶聯(lián)免疫法(ELISA)
酶聯(lián)免疫法在1971年以后開始被運(yùn)用到實(shí)驗(yàn)中，成為檢測食品中AFB1最簡單、方便的方法之一。ELISA的原理是利用抗原與抗體之間的高度特異性和酶的高效催化性，抗原或抗體與某種載體結(jié)合，在檢測時樣品中的酶標(biāo)抗原抗體與載體上的抗原或抗體會發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生抗原抗體的復(fù)合物，通過添加酶使產(chǎn)生的物質(zhì)快速顯現(xiàn)顏色，且AF的含量越高，底物的顏色越淺，從而達(dá)到檢測的目的，是一種可以定性定量分析的方法。該方法的關(guān)鍵點(diǎn)首先是抗原或抗體在檢測的過程中要一直保持活性，并且還可以與載體相結(jié)合;其次是酶在檢測的過程中要始終保持活性，即使是與抗原或抗體結(jié)合后，仍能發(fā)揮出酶的催化作用，但這種酶容易受溫度等多種因素的影響，所以一般將其在低溫下保存。常用的ELISA有直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法、抑制性測定法等。胡竹行等研究了酶聯(lián)免疫法檢測大曲中AFB1的提取條件，結(jié)果表明，在甲醇濃度為55%(v/v)、提取時間為25min、功率為200W時，其提取率明顯高于國家標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)前，為了更加方便而利用ELISA研發(fā)出酶聯(lián)免疫法分析試紙盒，并且已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)，為人們的生活提供便利。酶聯(lián)免疫法分析試紙盒沒有改變原理，且檢測的準(zhǔn)確性十分可靠，該方法目前被廣泛用于飼料原料中檢測AFB1的含量。李江等用酶聯(lián)免疫法對食用油中AFB1的測定結(jié)果與液相法比較，符合率高，能夠用于食用油中AFB1的快速、準(zhǔn)確檢測。
2.4 膠體金標(biāo)免疫層析分析法(GICA)
納米金是直徑1～100nm的金微小粒子，是一種帶負(fù)電的疏水膠體。膠體金標(biāo)免疫層析分析法就是利用納米金作為標(biāo)記底物，所需檢測時間較短，可直接讀取檢測數(shù)值，且該方法不需要對試樣進(jìn)行分離提純處理，也不用對檢測溶劑做處理，操作起來簡便且高效，是目前最簡單、最快速的檢測方法之一。GICA會使試樣中的AF與偶聯(lián)膠體金的抗AF抗體相結(jié)合，無論是結(jié)合的還是非結(jié)合的抗體都會沿著膜的移動，通過固定化的真菌毒素組成的檢測線，它將結(jié)合游離的抗體，以形成可見的線，以此來表示AF的污染低于試驗(yàn)的閾值。人們對于納米金的研究已經(jīng)有很長的時間，并在多個領(lǐng)域得到運(yùn)用。宋青龍等用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合膠體金定量讀數(shù)儀研制出一種檢測方法簡便、快速、穩(wěn)定性好，樣品檢測結(jié)果與高效液相色譜法檢測結(jié)果的相對誤差在20%以內(nèi)，快速定量檢測谷物和飼料中AFB1含量的膠體金快速定量檢測試劑盒。劉曉玥等通過用膠體金免疫層析法和酶聯(lián)免疫吸附法對飼料樣品的檢測進(jìn)行對比，結(jié)果表明，膠體金免疫層析試紙條法與酶聯(lián)免疫吸附法相符率可達(dá)95%以上，說明該方法操作簡單、快速、方便，可以應(yīng)用于谷物及飼料產(chǎn)品AFB1現(xiàn)場快速檢測。
3 小結(jié)
AF是廣泛存在于自然界中的真菌毒素，運(yùn)用較為廣泛的檢測方法有4種——薄層層析法是最早被運(yùn)用的方法，該方法同時具有定性和定量的分析功能，但隨著科技的發(fā)展迅速，如今出現(xiàn)了很多固相吸附材料，使薄層層析的準(zhǔn)確度也隨之上升，其精確度甚至可以與高效液相色譜相較量;高效液相色譜法對樣品的純度要求很高，但具有分析自動化的潛力，以及靈敏度高、精確度高等優(yōu)點(diǎn);酶聯(lián)免疫法的特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、簡便及無污染;而在熒光素、酶、同位素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后，納米金已經(jīng)成為的一種新型標(biāo)記技術(shù)。