微生物鑒定方法知多少？
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-05-17 09:36:57
微生物是與人類關(guān)系密切的生物群體，有些對人類是有益的，有些則是嚴(yán)重的病原體。物種水平鑒定可以辨別同一屬的兩個物種，這在治療傳染病方面是很重要的。本文總結(jié)一些細(xì)菌、酵母或絲狀真菌物種水平鑒定的傳統(tǒng)和現(xiàn)代方法。
微生物鑒定的用途
醫(yī)療保?。簻?zhǔn)確、快速地鑒定細(xì)菌、真菌和寄生蟲，以進(jìn)行正確和及時的疾病診斷，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委煛?br />
流行病學(xué)：為了追蹤病原體和追蹤疾病的傳播和暴發(fā)，以及鑒定新的隔離物，例如抗生素耐藥隔離。
制藥工業(yè)：由于微生物是對無菌性的重大威脅，對環(huán)境微生物的準(zhǔn)確鑒定通常是制藥行業(yè)良好的生產(chǎn)實(shí)踐(GMP)要求。
其他用途：包括刑事調(diào)查、微生物取證和環(huán)境研究等。
一、傳統(tǒng)方法
傳統(tǒng)的微生物鑒定方法依賴于表型鑒定，主要是用染色法、培養(yǎng)法和簡單的生化檢驗(yàn)。
宏觀特征
宏觀特征包括微生物的整體外觀，其形狀、大小、顏色和氣味等，可以用肉眼看到。通過在瓊脂培養(yǎng)基檢查其形態(tài)學(xué)/宏觀特征來確定微生物的類型。同一物種在不同的培養(yǎng)基中會出現(xiàn)不同的表現(xiàn)。
絲狀真菌或霉菌似乎是“毛狀”形狀不規(guī)則的菌落，經(jīng)常會產(chǎn)生可見的孢子，這些孢子可能看起來是粉狀的或布滿灰塵的。真菌菌落可以包含多種顏色，通常在中間有較深的顏色（中心通常凸起），從中心發(fā)射出較淺的顏色。絲狀真菌從瓊脂的中心呈放射性生長,最年輕的在外面，較老的深色物質(zhì)(富含孢子)在里面。絲狀真菌也可以呈單色絨毛狀生長，沒有明顯的孢子跡象。
細(xì)菌通常形成不同的菌落，有時比真菌菌落更小，質(zhì)地可以從粘滑到非常干燥，顏色可以從白色到鮮紅色不等。細(xì)菌通常有強(qiáng)烈的氣味，而絲狀真菌則可以是無味的。酵母可能是最難根據(jù)宏觀特征來鑒定的，其菌落通常看起來與細(xì)菌菌落相似，取決于物種和所使用瓊脂的類型。
微觀特性
通常通過染色使微生物在顯微鏡下更容易顯示出來，最常用的幾種染色方法如下：
a.革蘭氏染色法
革蘭氏染色通常是細(xì)菌鑒定的首選，基于結(jié)晶紫色染料。典型革蘭氏陽性菌有芽孢桿菌、葡萄球菌、鏈球菌和梭狀芽孢桿菌,而大腸桿菌、幽門螺桿菌和沙門氏菌則是革蘭氏陰性。但有些細(xì)菌是革蘭氏(染色)不定的，不適用于革蘭氏染色法。
b.芽孢染色
這項(xiàng)技術(shù)涉及將染色劑應(yīng)用于細(xì)菌樣本，以檢查孢子的存在。因?yàn)椴皇撬械募?xì)菌都能產(chǎn)生孢子，所以這些信息在鑒定中是有用的?？兹甘G可能是最受歡迎的孢子染色劑。
c.抗酸染色
這是結(jié)核分枝桿菌(TB)染色的一個重要工具，它不能被革蘭氏染色。首先使用石碳酸品紅進(jìn)行染色，然后再用一個復(fù)染劑，如亞甲基藍(lán)。結(jié)核桿菌被染成紅色，其他細(xì)菌則被染藍(lán)。
d.真菌與酵母菌染色
真菌的染色通常是將真菌元素可視化，而不是區(qū)分真菌種類。真菌染色的例子包括:
乳酸酚棉藍(lán)：是一種藍(lán)色的染色劑，將真菌細(xì)胞壁中的碳水化合物染色
PAS染色法：將碳水化合物和其他部分染色，只在活的真菌中產(chǎn)生洋紅色。這種方法在感染診斷中使用。
格羅克特烏洛托品銀染色：將真菌細(xì)胞壁的顏色染成黑色，但不能區(qū)分活的或死的物質(zhì)。
在植物/真菌共生和植物病理學(xué)的研究中，臺盼藍(lán)可以將真菌和植物結(jié)構(gòu)染色。
3.簡單的生化測試
a.過氧化氫酶試驗(yàn)
如果未知的細(xì)菌種類有過氧化氫酶的活性，當(dāng)過氧化氫被添加到顯微鏡載玻片上的細(xì)菌時，就會出現(xiàn)氣泡。葡萄球菌、微球菌、大腸桿菌和其他腸桿菌以及沙門氏菌是最常見的過氧化氫細(xì)菌，而鏈球菌和腸球菌則是過氧化氫酶陰性。
b.氧化酶試驗(yàn)
氧化酶試驗(yàn)鑒定細(xì)菌通過細(xì)胞色素c氧化酶(CCO)的活動，這種酶是細(xì)菌電子傳遞鏈的一部分。CCO將試劑(四甲基-對苯二胺)氧化為紫色的產(chǎn)物。當(dāng)不存在酶時，試劑處于無色的還原狀態(tài)。雖然氧化陽性細(xì)菌是需氧的，但它們不一定是嚴(yán)格的專性好氧菌，而且可能進(jìn)行無氧呼吸。同樣地，如果細(xì)菌物種具有一種不能與試驗(yàn)試劑反應(yīng)的氧化酶，你將獲得一個假陰性結(jié)果。
c.底物利用率測試
有許多用于微生物鑒定的底物利用率測試,這些測試(通常用于鑒定細(xì)菌物種)包含一組底物，比如不同的碳源和氮源。不同的細(xì)菌種類使用不同的底物，在細(xì)菌孵育后，記錄底物顏色的變化，生成一種底物率利用模式，再與電腦生成的其他細(xì)菌物種的模式進(jìn)行比較。這些測試與過氧化氫酶/氧化酶測試和顯微鏡觀察相結(jié)合可能會更可靠，。
d.二叉式檢索表
二叉式檢索表包含一系列的步驟，其中每一步都描述了兩種不同的特征，指導(dǎo)向下一步驟，直到鑒定完成使用此方法和上面列出的傳統(tǒng)方法來幫助你鑒定目標(biāo)有機(jī)體。
二、現(xiàn)代方法
傳統(tǒng)的鑒定方法雖然仍被廣泛使用，但存在兩大缺點(diǎn)。它們只適用于可以體外培養(yǎng)的生物體，而且一些菌株表現(xiàn)出不符合已知種屬模式的獨(dú)特的生化特性。許多現(xiàn)代方法并不依賴于活的培養(yǎng)物，它們常常能揭示通過傳統(tǒng)方法檢測不到的有機(jī)體之間的細(xì)微差別。
1.PCR鑒定
PCR，包括實(shí)時熒光定量PCR，可能是最廣泛應(yīng)用于微生物鑒定的分子技術(shù)。利用PCR技術(shù)，可以快速檢測和鑒定臨床標(biāo)本的微生物種類，從而加快診斷程序。大多數(shù)基于PCR的方法涉及一組通用的PCR引物，通過測序PCR擴(kuò)增的序列來鑒定細(xì)菌/真菌樣品。16S rRNA基因是PCR細(xì)菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)序列，而內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)區(qū)域是真菌種類的主要條碼標(biāo)記。
2.微陣列芯片識別
基于微陣列的微生物鑒定依賴于預(yù)先擴(kuò)增的微生物DNA序列與排列好的物種特異性的寡核苷酸探針的雜交。每一個探針含有一種不同的染料，在雜交過程中會發(fā)出熒光。 微陣列是一種多功能的工具，它能促進(jìn)不同微生物樣品的檢測和鑒別。微陣列技術(shù)是一種快速的技術(shù)，在臨床診斷和及時進(jìn)行適當(dāng)?shù)目咕委熤?，其速度是很重要的?；诨蛐酒钠脚_通常使用和其他PCR為基礎(chǔ)的方法類似的條碼區(qū)域。
3.免疫學(xué)
基于ELISA的方法可以用于在單個物種基礎(chǔ)上的微生物檢測(通常是診斷學(xué))。這些方法是高度敏感和特異性的，但依賴于特異性的抗體和目標(biāo)生物體中高度差別的蛋白質(zhì)。
4.化學(xué)分析
a.脂肪酸分析
脂肪酸在細(xì)菌細(xì)胞膜中是必不可少的，不同的細(xì)菌種類會產(chǎn)生不同的脂肪酸組合。因此，從一種未知的細(xì)菌種類中獲得的脂肪酸可以被用來識別物種，通過與已知的脂肪酸特征相匹配。脂肪酸分析通常采用氣相色譜分析和質(zhì)譜法聯(lián)用。
b.代謝指標(biāo)
除了ATP，ADP等初級代謝產(chǎn)物是生長的必要條件，微生物還產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，它們對生長不是必要的，但可能在某些環(huán)境中是有利的，比如與其他微生物競爭營養(yǎng)。次生代謝產(chǎn)物包括抗生素、免疫抑制化合物、色素、抗氧化劑等，這些代謝物是現(xiàn)有和新興藥物的一個巨大來源。不同的物種通常會產(chǎn)生獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，這些使我們能夠識別已知的微生物種類。代謝分析通常采用高效液相色譜和質(zhì)譜分析法。