酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備和保存！
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-05-17 09:42:39
酵母，如釀酒酵母、裂殖酵母和畢赤酵母，通常用于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。酵母是易于培養(yǎng)的單細(xì)胞真核生物，他們的基因和蛋白質(zhì)與哺乳動物具有很好的相似性，所以是優(yōu)秀的生物模型。
酵母細(xì)胞用于研究基因功能，蛋白質(zhì)相互作用，細(xì)胞通路等，也是大規(guī)模異源蛋白表達(dá)和小分子生產(chǎn)的卓越宿主，在發(fā)酵，釀造和制藥行業(yè)等起著中流砥柱的作用。涉及酵母的常見的實(shí)驗(yàn)有酵母雙/三雜交系統(tǒng)，突變體篩選庫和同源重組，等等。
一、為什么我們需要酵母感受態(tài)細(xì)胞?
通常，在實(shí)驗(yàn)過程中需外源DNA引入到酵母細(xì)胞。引入基因片段（線性ssDNA或質(zhì)粒）是通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)的，具體方法有化學(xué)法，如醋酸鋰和聚乙二醇(PEG)或電穿孔法。有效的酵母轉(zhuǎn)化需要高質(zhì)量的酵母感受態(tài)細(xì)胞為開始。勝任力則是指細(xì)胞能吸收游離的細(xì)胞外的遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒DNA)的能力。
二、酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
獲得感受態(tài)細(xì)胞相當(dāng)簡單，但許多研究人員在實(shí)現(xiàn)良好的生存比例和轉(zhuǎn)換效率時(shí) 遇到問題。常見的誤區(qū)包括由于制備條件惡劣導(dǎo)致高的細(xì)胞死亡率，或由于無效的感受態(tài)細(xì)胞制備導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低。
雖然酵母細(xì)胞和大腸桿菌一樣容易生長和轉(zhuǎn)化，但它們需要不同的處理方法來制備感受態(tài)細(xì)胞和轉(zhuǎn)化。酵母細(xì)胞像哺乳動物細(xì)胞一樣，有類似的處理程序。典型的酵母感受態(tài)細(xì)胞制備協(xié)議如下:
過夜培養(yǎng)你想轉(zhuǎn)化的酵母菌菌株，使用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基培養(yǎng)不含質(zhì)粒的細(xì)胞。對于已經(jīng)含有質(zhì)粒的細(xì)胞，使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)基來維持質(zhì)粒。
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1 - 2 x 107cells/mL，離心收獲細(xì)胞。細(xì)胞密度可以通過使用分光光度計(jì)在OD600檢測，或者使用血球計(jì)在顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞。
沖洗細(xì)胞，重懸于無菌水，離心，棄上清，重復(fù)此步驟兩次以徹底清洗細(xì)胞。
最后一次洗完，將細(xì)胞重懸于感受態(tài)細(xì)胞溶液，分裝，大約每管108個(gè)細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)將使用這些數(shù)量的細(xì)胞。分裝好的管子放于-80°C，供以后實(shí)驗(yàn)使用。
在所有步驟中,使用質(zhì)量好的無菌過濾器消毒過的試劑,以防止污染問題。
感受態(tài)細(xì)胞溶液包含最佳濃度的冷凍保護(hù)劑，這些濃度應(yīng)該在你的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)使用的酵母菌株和細(xì)胞的濃度。標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議使用5%的甘油 + 10% DMSO溶液混合,這種配方被廣泛應(yīng)用來制備感受它細(xì)胞，也可根據(jù)具體情況進(jìn)行輕微的改變或調(diào)整。
關(guān)于冷凍保護(hù)劑
甘油和二甲亞砜(DMSO)是最常見的細(xì)胞可透過性冷凍保護(hù)劑，用于準(zhǔn)備感受態(tài)細(xì)胞。它們穿透細(xì)胞，防止冰晶的形成，冰晶可能會在凍結(jié)過程中導(dǎo)致膜破裂。甘油和DMSO也有一定的缺點(diǎn)，他們可能會導(dǎo)致細(xì)胞毒性,特別是在解凍過程中。非細(xì)胞透過性的試劑如蔗糖和海藻糖等也可用于替代物。山梨糖醇鈣也是一個(gè)好的冷凍保護(hù)劑，尤其適用于電穿孔制備感受態(tài)細(xì)胞。
三、酵母感受態(tài)細(xì)胞的儲存
每次轉(zhuǎn)化時(shí)使用新鮮的感受態(tài)細(xì)胞是明智的，因?yàn)殚L時(shí)間儲存，轉(zhuǎn)化效率會降低，但這并不總是可行的。
感受態(tài)細(xì)胞可以存儲在-80°C長達(dá)一年，沒有轉(zhuǎn)化潛能的損失。然而, 瞬間凍結(jié)在液氮或-80°C冰箱是不建議的。感受態(tài)細(xì)胞需要在冷凍保護(hù)劑中，像哺乳動物細(xì)胞一樣緩慢地冷凍。
使用硬紙板或聚苯乙烯泡沫塑料盒等儲存。
用紙片等將盒子里的細(xì)胞管隔開，分成多個(gè)小格子。
復(fù)蘇過程中，在37°C解凍細(xì)胞，轉(zhuǎn)化前用豐富培養(yǎng)基清洗防凍劑。