一、背景
小鼠腸微血管細(xì)胞試劑盒適合于培養(yǎng)小鼠的腸微血管細(xì)胞。
本試劑盒包含：
（1）OptiTDSTM小鼠腸微血管細(xì)胞組織解離液
（2）小鼠腸微血管細(xì)胞組織處理緩沖液
（3）FibrOutTM小鼠腸微血管細(xì)胞成纖維抑制劑
（4）小鼠腸微血管組織洗液
（5）小鼠腸微血管細(xì)胞生長因子及血清
（6）小鼠腸微血管細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基
（7）小鼠腸微血管組織預(yù)備液。
微血管是指心血管系統(tǒng)的微細(xì)血管，它們在顯微鏡下才能見到。微血管指通連小動(dòng)脈和小靜脈間的細(xì)小血管，分布于各種組織和器官中，分支通連成網(wǎng)，故也稱終末血管床。小鼠腸微血管細(xì)胞可以保持原代細(xì)胞的分化狀態(tài)，進(jìn)而可以用于評(píng)估體外藥物模型系統(tǒng)和調(diào)節(jié)特定基因的遺傳功能。雖然腸微血管組織機(jī)械韌性很強(qiáng)，但利用小鼠腸微血管細(xì)胞試劑盒中提供的腸微血管組織分離體系來分離，EDTA/EGTA處理過的腸微血管組織能使得腸微血管組織中微血管細(xì)胞的一些功能特性發(fā)生改變，從而將腸微血管細(xì)胞分離開來。
二、應(yīng)用
用于巨噬細(xì)胞金屬彈力酶基因轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞對(duì)小鼠原位結(jié)腸癌生長及微血管生成的影響
巨噬細(xì)胞金屬彈力酶(mouse macrophage metalloelastase,MME)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成員之一,也稱MMP-12。與其它MMP成員不同,MME可以分解纖溶酶原,產(chǎn)生具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用的血管抑素(angiostatin),進(jìn)而抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長,在抗腫瘤血管生成中具有重要作用。方法PCR擴(kuò)增編碼MME基因結(jié)構(gòu)域Ⅰ和Ⅱ的cDNA片段,克隆入pGEM-T載體中,限制性內(nèi)切酶、DNA序列分析鑒定目的基因后,定向亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中,并進(jìn)行雙酶切及PCR鑒定。再將構(gòu)建的真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1-MME穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠CT-26結(jié)腸癌細(xì)胞。采用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法,鑒定MME mRNA和重組蛋白在CT-26細(xì)胞中的表達(dá)。
采用體外分解Ⅰ型膠原蛋白和明膠酶譜方法,鑒定MME重組蛋白的酶活性。建立MME轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組小鼠原位結(jié)腸癌種植模型,觀察MME對(duì)原發(fā)性結(jié)腸癌生長的影響,采用免疫組織化學(xué)、原位雜交及Western blot方法檢測腫瘤組織中微血管密度(microvessel density,MVD)和VEGF的表達(dá)。結(jié)果以重組質(zhì)粒pUC9-MME cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,在1%瓊脂糖凝膠電泳中可見一條清晰的條帶,位于750bp和1000bp之間,與預(yù)期的840bp目的基因片段長度相符。pGEM-T-MME用BamHI和XbaI雙酶切,產(chǎn)生2個(gè)大小分別為3.0kb和832bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果基本一致。pGEM-T-MME核苷酸序列正向測序和反向測序結(jié)果表明,與小鼠MME cDNA序列的堿基符合率為99.63%。
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