一、背景
小鼠組織直接PCR試劑盒是一款可快速對小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等組織樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒。本試劑盒采用獨(dú)特的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應(yīng)。此外，樣品使用量少，低至5mg小鼠組織或2-5mm鼠尾即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠組織直接PCR試劑盒包含了快速制備小鼠組織基因組DNA和后續(xù)PCR擴(kuò)增的所有試劑，適用于從小鼠尾巴、耳朵以及腳趾等組織中一步法提取基因組DNA并用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增和檢測。整個(gè)提取過程不包含勻漿、破碎、過夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式純化等操作，實(shí)驗(yàn)操作簡便、快捷，而且結(jié)果穩(wěn)定可靠。
小鼠組織直接PCR試劑盒提供的2 x Dir PCR MasterMix是一種高擴(kuò)增兼容性的PCR試劑，無需徹底去除蛋白等雜質(zhì)，便能進(jìn)行高效特異擴(kuò)增。該預(yù)混Mix包含抗體修飾的Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑和穩(wěn)定劑，操作時(shí)只需加入粗提模板和引物即可進(jìn)行后續(xù)檢測，具有操作簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，特別適合于高通量的檢測篩選。Mix中預(yù)混有電泳染料，可在反應(yīng)結(jié)束后直接進(jìn)行電泳檢測，使用方便快捷。PCR產(chǎn)物的3’端帶A，可進(jìn)行TA克隆。
二、操作方法
樣品基因組DNA釋放
⒈在離心管中加入100μL Buffer MP，4μL Protease Plus，輕輕渦旋混勻。
⒉取5-10mg動(dòng)物組織或2-5mm鼠尾，置于上述離心管中，輕輕渦旋混勻。
⒊65℃孵育10-30min，然后95℃處理5min。
⒋12000rpm離心5min。
⒌將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管，4℃或-20℃保存或直接用于PCR擴(kuò)增。
三、應(yīng)用
用于FAM76B在小鼠各組織中的表達(dá)分布和FAM76B基因敲除對小鼠肝臟脂代謝影響的初步研究
FAM76B是由339個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞核蛋白,分子量約為39kDa。人源的FAM76B基因定位于11q21染色體上,全長21468bp,生物學(xué)功能尚不明確。通過氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)人的FAM76B氨基酸序列與大鼠、小鼠以及斑馬魚的FAM76B氨基酸序列相似度極高,說明FAM76B氨基酸序列高度保守,也暗示了FAM76B蛋白可能存在重要的生物學(xué)功能。
目前已知FAM76B氨基酸序列中存在組氨酸重復(fù)序列(poly-His domain)和Lys-225的泛素化(ubiquitination)位點(diǎn)。通過基因本體(Gene Ontology,GO)分析表明,含有組氨酸重復(fù)序列的蛋白大多數(shù)為核蛋白,其生物學(xué)功能與基因轉(zhuǎn)錄和神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)。FAM76B蛋白定位在細(xì)胞核的核散斑體(Nuclear speckles)中,而核散斑體屬于細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu),可對RNA剪切復(fù)合體進(jìn)行保存和組裝。1.FAM76B單克隆抗體的制備及鑒定:用純化的原核人FAM76B-6His融合蛋白免疫Balb/c小鼠,取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合;以純化的人FAM76B-6His作為包被抗原,采用間接ELISA方法篩選出陽性克隆的雜交瘤細(xì)胞。通過有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行亞克隆,將最終陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),制備針對人FAM76B的單克隆抗體6株,分別命名為FAM76B McAb No.1-6。采用Western blot、免疫沉淀以及免疫細(xì)胞化學(xué)染色等手段,對所獲得的單克隆抗體進(jìn)行一系列的檢測。
FAM76B蛋白在正常小鼠組織中的表達(dá)和分布:將人FAM76B蛋白的氨基酸序列與小鼠FAM76B蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)兩者氨基酸序列相似度可達(dá)到98%,說明FAM76B蛋白高度保守。用上述所獲的針對人FAM76B的單克隆抗體對鼠源FAM76B蛋白進(jìn)行檢測,同時(shí)通過Real-time PCR、Western blot及免疫組化的方法檢測FAM76B在正常小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉以及腦組織的表達(dá)和分布。通過PCR、Real-time PCR以及Western blot方法對本實(shí)驗(yàn)室繁育的FAM76B基因敲除小鼠后代,在基因組水平、RNA水平以及蛋白水平進(jìn)行鑒定。
FAM76B基因敲除小鼠肝臟脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的分析:利用Real-time PCR方法,檢測1,3,6,9,12,15月齡FAM76B+/-小鼠肝臟組織脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平:de novo lipogenesis環(huán)節(jié)中FASN、SCD、ACC、Dgat 1和Dgat 2;脂肪酸氧化途徑中Cptl、Acox和Mcad;TG分泌過程中Mtp和Vldlr。同時(shí)檢測lipin1、SREBP-1、PPARα和PGC-1α的mRNA相對表達(dá)量。通過上述研究結(jié)果,分析FAM76B基因敲除小鼠肝臟脂代謝異常的主要因素和途徑。
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