一、背景
大鼠原代軟骨細胞存在于關(guān)節(jié)軟骨中，負責(zé)分泌II型膠原和其它類型的膠原以及非膠原的細胞外基質(zhì)大分子。成軟骨細胞的增殖和分化與脊椎動物骨架的發(fā)育有著密切的關(guān)系。軟骨細胞能分泌和響應(yīng)一系列的生長因子，包括IGF-1和IL1。體外培養(yǎng)的軟骨細胞是研究軟骨修復(fù)和關(guān)節(jié)炎病理的有用模型。
二、胞復(fù)蘇操作要點
1、將基在37℃水浴鍋預(yù)熱；一個15mL無菌的離心管，加入8mL預(yù)熱基。
2、將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)完全解凍，使細胞能盡快通過易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，避免引起污染。
3、用75%酒精凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至好的離心管內(nèi)，輕輕吹打，使細胞均勻分散，DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。
4、800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的基，吹打制成細胞懸液。
5、將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)。
6、第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮基以去除死細胞。繼續(xù)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復(fù)后才能進行后續(xù)的實驗。
三、細胞特性
1、組織來源于實驗動物的關(guān)節(jié)組織。
2、細胞鑒定：Ⅱ型膠原(CollagenⅡ)免疫熒光染色為陽性。
3、經(jīng)鑒定細胞純度高于90%。
4、不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌。
5、細胞生長方式：長梭狀，不規(guī)則細胞，貼壁培養(yǎng)。
四、貼壁細胞傳代
1、提前將基、PBS放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用75%酒精后再放入超凈臺內(nèi)。
2、吸除或倒掉細胞瓶內(nèi)舊液，加少量PBS潤洗細胞。
3、加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細胞，37℃孵育，每隔2~3min顯微鏡下觀察，待貼壁細胞間間隙變大、細胞趨于圓形但還未漂起時棄去胰酶，加入新鮮基，晃動細胞瓶，終止胰酶作用。原代細胞大鼠軟骨細胞采購商
4、用吸管小心吹打貼壁的細胞，制成細胞懸液?？刂拼荡虻牧Χ?，避免產(chǎn)生大量的氣泡。
5、將細胞懸液分別接種到另外的2~3個細胞瓶內(nèi)，加入新鮮基，置37℃溫箱，隔天觀察貼壁生長情況。
五、應(yīng)用
大鼠原代軟骨細胞可用于促甲狀腺激素對小鼠原代軟骨細胞增殖和分化的影響：
甲狀腺功能減退癥(subclinicalhypothyroidism,SCH),簡稱亞甲減,是臨床上常見的內(nèi)分泌代謝性疾病。亞甲減患者雖然甲狀腺激素水平在正常范圍內(nèi),但是血清中促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平升高,偏離正常參考范圍。已有研究證實,高TSH與甲狀腺功能減退的小鼠骨骼發(fā)育異常有關(guān),然而其細胞機制仍不清楚。
方法：1、小鼠原代軟骨細胞(PMCs)的培養(yǎng)及處理:取小鼠膝關(guān)節(jié),去除周圍結(jié)締組織,將軟骨組織與深層軟骨下骨仔細分離,緩沖液沖洗,剪碎軟骨組織后用0.1%膠原酶消化18.5 h,離心去上清,依次經(jīng)100μm和40μm濾網(wǎng)過濾。洗滌后用含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗和100μM維生素C的培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隔天換液,待細胞融合度達到70%-80%時,換成含1%FBS的培養(yǎng)基分別以不同處理培養(yǎng)48h,盡可能減少血清中脂蛋白及各種激素對實驗的干擾作用。
2、用10 mU/ml bTSH處理PMCs特定的時間,設(shè)置對照組。用CCK8和EdU試劑盒檢測細胞增殖活性。
3、用JC-1檢測細胞線粒體膜電位的改變來觀察細胞凋亡情況。應(yīng)用Western blot檢測促凋亡因子Bax和Bcl-2的表達水平。
4、用Western blot和免疫熒光染色檢測自噬相關(guān)標(biāo)志物如LC3、Beclin-1和p62,Western blot mTOR、p-AMPK和AMPK,用透射電鏡檢測PMCs的自噬情況。
5、采用Alcian blue染色檢測亞甲減小鼠和正常小鼠軟骨蛋白聚糖的表達水平。通過免疫熒光染色檢測collagen ll和collagen l的表達情況。
6、通過RT-PCR檢測不同整合素亞基的表達情況。結(jié)果1.CCK-8細胞增值活性檢測發(fā)現(xiàn),細胞活性在高濃度TSH(10 mU/ml)刺激24h后下降明顯,低濃度組(1 mU/ml)在TSH刺激72h后,細胞增殖活性也比對照組產(chǎn)生顯著降低(P<0.05),并持續(xù)下降。
EdU細胞增殖檢測結(jié)果也表明,10mU/mlTSH刺激48h顯著降低PMCs增殖能力(P<0.01),對照組有增值活性的細胞百分比為TSH刺激組的6倍。2.流式結(jié)果顯示,TSH刺激增加線粒體膜電位的去極化,細胞發(fā)生凋亡。通過Western blot實驗進一步驗證,TSH刺激使促凋亡因子BAX蛋白表達增加(P<0.01),Bcl-2表達水平降低(P<0.01),Bcl-2與BAX蛋白表達水平的比值降低(P<0.05)。3.TSH刺激降低軟骨細胞自噬水平。Western blot檢測結(jié)果表明,LC3 11(P<0.05)和Beclin-1(P<0.01)的表達水平降低,且在免疫熒光試驗的結(jié)果中得到了驗證。
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