一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、熟悉常用微生物培養(yǎng)基的配制方法。
2、學(xué)習(xí)并掌握各種無菌操作技術(shù)，并用此技術(shù)進(jìn)行微生物稀釋分離、劃線分離接種。
3、用平板劃線法和稀釋法分離微生物。
4、認(rèn)識(shí)微生物存在的普遍性，體會(huì)無菌操作的重要性。
二、實(shí)驗(yàn)原理
1、微生物的分離與純化
土壤是微生物生活的大本營，在這里生活的微生物無論是數(shù)量還是種類都是極其豐富的。因此，土壤是微生物多樣性的重要插所，也是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從土壤中分離、純化得到許多有價(jià)值的菌株。
從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)雪養(yǎng)、酸堿度、濃度和氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某些抑制劑抑制其他菌生長而利于此菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物．再用稀釋涂布平板法或稀釋后平板劃線分離，純化該微生物，直至得到純菌株。
2、平板菌落計(jì)數(shù)法
平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，使其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落應(yīng)代表原樣品中的一個(gè)單細(xì)胞．統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)其稀釋倍數(shù)和取樣接種量即可換算出樣品含菌數(shù)。
平板菌落計(jì)數(shù)法雖然操作繁瑣，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能取得，而且測定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該計(jì)數(shù)方法的最大優(yōu)點(diǎn)是可以獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗(yàn)(如活菌制劑)，以及食品、飲料和水(包括水源水)等的含菌指數(shù)或污染程度的檢測。
三、實(shí)驗(yàn)材料
土樣10g，未知菌變形桿菌單菌落平板和無菌水。取液器(5m1、l000ml各一支)，培養(yǎng)箱，培養(yǎng)皿(20個(gè))，無菌有帽試管，三角瓶，無菌涂棒，接種環(huán)，5ml、1ml無菌吸頭（移液管），記號(hào)筆，酒精燈，火柴，試管架，牙簽。
四、實(shí)驗(yàn)步驟
(一)培養(yǎng)基的制備(提前準(zhǔn)備)
按以下步驟制備牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基，每組20個(gè)平板。
1、培養(yǎng)基的制備原則：適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分；合適的酸堿度，配制后經(jīng)滅菌手續(xù)方可使用。
2、培養(yǎng)基配制的基本程序：稱量一溶化一測定及矯正pH一過濾一分裝—滅菌備用(若配制固體平板培養(yǎng)基，則先滅菌后再傾倒平板備用)。
3、培養(yǎng)基制備過程
(1)稱量：按配方及配制的總量計(jì)算各種成分所需的量分別稱取。
(2)溶解：將各種成分放入三角瓶(三角瓶體積要大于所裝培養(yǎng)基體積2倍為宜)中，加自來水(一般配完全培養(yǎng)基用)或蒸餾水至所配培養(yǎng)基的總量，在微波爐中加熱溶解，觀察液體沸騰情況，在液體溢出之前，馬上斷開電源，反復(fù)多次，直到完全溶解。
(3)調(diào)pH值：初溶解好的培養(yǎng)基pH可能不符合要求，需用lmol／L NaOH或lmol／LHCI調(diào)pH至所需范圍，
(4)過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于結(jié)果觀察．一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去(本實(shí)驗(yàn)無需過濾)。
(5)分裝：按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。
液體分裝：分裝體積不超過三角瓶體積一半。
固體分裝：培養(yǎng)基高度為試管的1／3為宜，配斜面培養(yǎng)基時(shí)，一般每試管(直徑為10mm)加5ml左右培養(yǎng)基。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。
半固體分裝：培養(yǎng)基高度為試管高度的1／3為宜。
(6)加塞、包扎和滅菌：分裝后，試管用試管帽，三角瓶用無菌培養(yǎng)容封口膜（棉塞）封好瓶口，作好標(biāo)記，注明培養(yǎng)基的名稱及配制日期。放人高壓滅菌鍋內(nèi)，加熱沸騰，排空鍋內(nèi)空氣，以蒸汽劇烈噴出為準(zhǔn)，然后升壓到0.1MPa、穩(wěn)壓0.11MPa(121'C)滅菌20min，或全自動(dòng)高壓滅菌鍋中設(shè)定121'C、15~20min滅菌，如果培養(yǎng)基體積較大或含有糖蜜等容易受污染的營養(yǎng)復(fù)合物時(shí)，可適當(dāng)延長滅菌時(shí)間．
(7)擺斜面和倒平板：制斜面培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)在未凝固前將試管有塞的一頭擱在試管架底層、試管底部擱在桌面，形成斜面，斜度要適當(dāng)，斜面長度約為試管長度的1／2，培養(yǎng)基上部離管口5cm以上，凝固后即成斜面．制平板培養(yǎng)基時(shí)，可將培養(yǎng)基冷卻至60～70℃，無菌操作將培養(yǎng)基倒人已滅菌并干燥的培養(yǎng)皿中，讓其自然流滿整個(gè)子皿底或輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使其布滿平皿底，蓋上平皿盞，水平靜置，等凝固后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿．每平皿裝量 15~20ml (490mm)，使厚度達(dá)2~3mm。倒平板時(shí)，一般疊放培養(yǎng)皿，以免過多蒸汽凝結(jié)在皿蓋上。
(8)無菌檢查：特制好的培養(yǎng)基置37℃溫箱孵育24h，如無雜菌生長即可使用(此步一般省略)．
(9)較長時(shí)間不用的斜面或平板可用鋁箔包好，放置4'C冰箱備用。
（二)周圍環(huán)境中微生物的檢測
在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上作如下實(shí)驗(yàn)：
l、取一個(gè)平板，分成4區(qū)，做好標(biāo)記(下同)．用未洗過的手指頭以及肥皂洗過1次、2次、3次的手指頭(不用毛巾擦)分別在4個(gè)區(qū)上涂抹(用力一致)。
2、取一個(gè)平板，分區(qū),用正在使用的紙巾、硬幣分別在不同的區(qū)上拖動(dòng)2～3次。
3、往培養(yǎng)基上放置一根頭發(fā)，并用無菌涂布器壓緊。
4、取一個(gè)子板，將稍稍打開的嘴唇在培養(yǎng)基上壓一下，檢查嘴唇上的細(xì)菌。
5、取一個(gè)平板，分區(qū)，用無菌接種環(huán)分別沾一環(huán)自來水、河水以及礦泉水在平板不同區(qū)上畫線。
6、用無菌牙簽取一點(diǎn)牙垢在一個(gè)平板培養(yǎng)基上畫線。
7、取兩個(gè)乎板，一個(gè)打開皿蓋，置實(shí)驗(yàn)臺(tái)上(空氣中)l0min，另一個(gè)按無菌操作要求在酒精燈火焰邊打開皿蓋lmin。
8、取一個(gè)平板，打開皿蓋，對(duì)著培養(yǎng)基咳嗽。
9、另兩個(gè)平扳可根據(jù)自己的興趣，自由用來檢測。
以上平板用報(bào)紙包好倒置于37℃培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。
任何一個(gè)實(shí)驗(yàn)，在動(dòng)手操作前均需先用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底做好標(biāo)記。標(biāo)記包括培養(yǎng)物名稱、班級(jí)、姓名、日期．標(biāo)記應(yīng)明了、占地少，并做在乎皿底邊緣，不要做在中間，以免影響結(jié)果觀察。
本組的平板要統(tǒng)一用報(bào)紙包好，在外面寫上組號(hào)，以免同學(xué)拿亂，找不到自己的平板。
(三)從土壤中分離微生物
1、采土樣：選擇較肥沃韻土壤，鏟去表層土，挖5~20cm深度的或特殊要求的土壤數(shù)十克，裝入已滅菌的牛皮紙袋，封好袋口，做好編號(hào)記錄，帶回實(shí)驗(yàn)室供分離用。
2、制備土壤稀釋液，稱取土樣1.0g，放人盛99ml無菌水井帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩5min使土壤均勻分散成為土壤懸液(10-2)。用1ml的無菌吸頭從中吸駐0.5ml土壤懸液，注人事先分裝有4.5ml無菌水的試管中，吹吸3次，振蕩均勻(10-3)。換一只新的無菌吸頭，用同樣方法，分別配置成稀釋度為10-4、10-5、10-6的土壤溶液。
3、涂布：用一只新的無菌吸頭，分別由各濃度土壤稀釋液中各吸取100μ1，對(duì)號(hào)較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻，一定要多涂幾遍，從概率角度來說，涂到細(xì)菌均勻分布為止，此步是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。每個(gè)濃度做3個(gè)平板。
4、培養(yǎng)：將牛肉蛋白胨培養(yǎng)基平板倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h，統(tǒng)計(jì)所長出的菌落數(shù)。
5、菌落計(jì)數(shù)；培養(yǎng)24h后，取出培養(yǎng)乎板，算出同一稀釋度三個(gè)平扳上的菌落平均數(shù)，換算出土樣中的菌含量。
有較大片菌苔生長時(shí)，棄用，以無大片菌苔生長的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)；如成片菌苔大小不到培養(yǎng)皿的一半，其余一半分布均勻，將此一半計(jì)數(shù)×2。
選擇平均菌落數(shù)在30~300間的平板。只有一個(gè)濃度符合此范圍時(shí)，以該平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)即為該樣品中菌總數(shù)；有兩個(gè)濃度平板的菌落數(shù)在30-300時(shí)，按兩者菌落總數(shù)比值決定：比值小于2，取平均，比值大于2，取較少的菌落總數(shù)：
所有菌落數(shù)均大于300，取稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)；
所有菌落數(shù)均小于30，取稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)。
所有菌落數(shù)均不在30~300間，以最接近30或300的平均菌落乘以稀釋倍數(shù)。
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