一、背景
胞漿蛋白提取試劑盒用于哺乳動物組織和細(xì)胞中提取胞質(zhì)蛋白，試劑盒中的裂解液含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，作用較為溫和，可獲得蛋白，可用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)等基礎(chǔ)研究實(shí)驗(yàn)，由于含有上述的酶抑制劑，不能用于研究蛋白激酶和磷酸激酶的研究。
二、操作方法
1、組織總蛋白的提取
在1ml的冷裂解液中各加入10ul的磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和PMSF；混勻，放置在冰上備用；稱取0.1g的新鮮組織，放置于玻璃勻漿器的入口緩沖處，用眼科剪將組織塊盡可能的剪碎，然后加入0.5-1ml的新配置的裂解液，研磨直至沒有明顯的組織塊，這個過程注意冰上操作；將組織勻漿液移入1.5ml的EP管中，4 oC 12000g離心30min；吸取上清至新的管中；進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。
2、細(xì)胞總蛋白的提取
裂解液的用量：107個細(xì)胞需要裂解液1ml；
貼壁細(xì)胞：棄去培養(yǎng)基，用冷的PBS洗兩次，棄去PBS，然后加入計(jì)算好的細(xì)胞裂解液；在冰上用細(xì)胞刮刀進(jìn)行刮離細(xì)胞，將刮離的細(xì)胞裂解液移入EP管中，顛倒裂解20-30min。
懸浮細(xì)胞：4 oC 400g離心收集細(xì)胞，用冷的PBS洗兩次細(xì)胞，同樣按細(xì)胞數(shù)加入裂解液，渦旋10s，放置冰上裂解10min，重復(fù)3-4次；裂解完畢之后，將細(xì)胞裂解液4 oC 12000g離心30min；將上清移入新的EP管中；進(jìn)行蛋白定量或者變性進(jìn)行蛋白實(shí)驗(yàn)。
三、應(yīng)用
用于肝細(xì)胞核蛋白及胞漿蛋白誘導(dǎo)建立的系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)媚Ｐ脱芯浚?br />
為了建立經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定、簡便、可重復(fù)性強(qiáng),并能提供足量研究樣本的系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)媚Ｐ?以便于今后進(jìn)一步進(jìn)行SLE發(fā)病機(jī)制和治,療學(xué)的研究。
方法：選取1歲齡體重約2.5kg雌性新西蘭白兔50只,隨機(jī)分為5組,每組10只。提取同種異體肝臟細(xì)胞核蛋白及細(xì)胞漿蛋白,設(shè)首次注射時間為第0天,于第0天及第1、2、4、6、8、10、12周末予實(shí)驗(yàn)組兔蛋白提取物500μg/次(濃度為：1 mg/ml),其中,實(shí)驗(yàn)組1皮下注射肝細(xì)胞核蛋白,實(shí)驗(yàn)組2皮下注射肝細(xì)胞漿蛋白,實(shí)驗(yàn)組3經(jīng)靜脈注射肝細(xì)胞漿蛋白；相同時間點(diǎn)予對照組1皮下注射等體積PBS,予對照組2靜脈注射等體積PBS。
實(shí)驗(yàn)組1、2及對照組1首次注射時將抗原制劑與完全弗氏佐劑等體積乳化。于第1周開始至第18周末,每兩周于耳緣靜脈采集各組兔血液,并以特制兔體液收集代謝籠收集各組兔24h尿。觀測各組兔血Scr、BUN、TP、ALB、ALT、AST等生化指標(biāo)及24h尿蛋白含量；用ELISA法測定各組兔血清ANA、抗dsDNA抗體及抗Sm抗體。并于第18周末處死所有實(shí)驗(yàn)動物。
皮膚組織經(jīng)HE和免疫組化染色；腎臟組織行HE染色、Masson染色和免疫組化染色,并對腎臟和皮膚病變的嚴(yán)重程度及范圍進(jìn)行半定量分級。
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