1、目的：探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。
2、方法：以2005年廣東省疾病預(yù)防控制中心組織的微生物實驗室間比對試驗為例，對3號項目考核樣品使用現(xiàn)行有效的微生物檢驗技術(shù)規(guī)范和相關(guān)傳染病診斷標(biāo)準進行鑒定。
3、結(jié)果：根據(jù)組織單位提供的已知提示，并充分利用自己的已知知識，盡量縮小范圍，檢出3號項目考核樣品是宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相和福氏志賀菌2a型的混合菌株。
4、結(jié)論：參加微生物檢驗比對考核時要充分利用已知知識進行檢驗，并要留意樣品是純菌株還是混合菌株。
在微生物檢驗中，無論是日常工作或是比對考核，如果不知菌株來源，即不知菌株采集于人體何部位，采集于何種食物、使用物品或環(huán)境時，對未知菌株的分離鑒定，目前沒有固定的檢驗程序，只有在確定了菌株的來源或針對性要檢驗?zāi)硞€可疑菌屬，才有相關(guān)來源菌的檢驗流程或相關(guān)菌屬的檢驗程序。微生物檢驗比對考核一般說明菌株來源或指明了某一方向，對未知菌株進行鑒定時可以根據(jù)這些提示來縮小檢驗范圍。下面以2005年廣東省疾病預(yù)防控制中心組織的微生物實驗室間比對試驗為例，探討微生物檢驗比對考核的檢驗思路。對3號項目考核樣品進行檢驗，檢驗思路和檢驗結(jié)果如下。
一、對象、試劑、儀器和方法
1、對象
廣東省疾病預(yù)防控制中心提供的比對考核3號項目考核樣品。
2、試劑
各種微生物檢驗用染色液試劑、增菌培養(yǎng)基試劑、分離培養(yǎng)基試劑、生化試驗試劑和鑒定血清試劑。
3、儀器
生化培養(yǎng)箱、冰箱、顯微鏡。
4、方法
《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第2版）-1997;《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗》GB/T4789.1～31-2003;《傳染病診斷標(biāo)準及相關(guān)法規(guī)匯編》-2003。
二、檢測思路和檢測結(jié)果
1、樣品來源及樣品性狀
廣東省疾病預(yù)防控制中心提供的微生物實驗室間比對項目的3號項目樣品，是從1例急性腸道傳染病病人糞便中分離出的腸道致病菌培養(yǎng)物，屬需氧或兼性厭氧菌。該樣品為子彈管裝凍干粉劑菌株，樣品運送溫度為常溫。
2、檢測思路
從已知條件來看，從需氧狀況看，該菌株屬需氧或兼性厭氧菌可以排除厭氧菌;運送溫度為常溫，說明該菌株是中溫菌，可以排除嗜冷菌、嗜熱菌;該菌株來源于1例急性腸道傳染病人的糞便，說明該菌株為腸道菌，而且是致病菌，可引起急性致病，可以排除腸道正常菌群和腸道條件致病菌。根據(jù)《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第2版）-1997提供的糞便標(biāo)本中常見的病原菌種類，不是厭氧菌的革蘭陽性菌有:金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌;革蘭陰性菌有傷寒及其它沙門菌、志賀菌、致病大腸埃希菌、弧菌屬菌種、氣單胞菌種、鄰單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、彎曲菌。鑒定時可以將范圍縮至這11種菌，培養(yǎng)基可以選擇這11種菌的增菌培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基。在選擇增菌培養(yǎng)基和分離培養(yǎng)基時，要充分考慮各種類型的常用培養(yǎng)基和專用培養(yǎng)基。
3、培養(yǎng)、觀察和鑒定
（1）復(fù)蘇培養(yǎng)
由于該樣品為子彈管裝凍干粉劑菌株，無法直接涂片鏡檢，必須進行復(fù)蘇培養(yǎng)。用接種環(huán)挑取凍干粉劑菌株分別接種于營養(yǎng)肉湯中，36℃分別培養(yǎng)6h;接種于加有血清的布氏肉湯中，43℃微需氧培養(yǎng)8h。
（2）接種
挑取—接種環(huán)于營養(yǎng)肉湯分別直接劃線接種于一塊普通瓊脂平板和一塊血瓊脂平板中，36℃培養(yǎng)24h。同時接種普通瓊脂平板和血瓊脂平板，除可以觀察菌落形態(tài)特征外，還可以互相對比觀察該菌的營養(yǎng)要求、色素及溶血性等。
（3）增菌培養(yǎng)
吸取生長良好的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物0.5ml接種于下列增菌液:堿胨水、SC增菌液、GN增菌液、腸道菌增菌肉湯、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液、7.5%氯化鈉肉湯、改良PBS。其中GN增菌液36℃培養(yǎng)6h、堿胨水36℃培養(yǎng)8h，改良PBS4℃培養(yǎng)1天、3周，其它增菌液36℃培養(yǎng)24h。吸取加有血清的布氏肉湯培養(yǎng)物0.5ml接種于CEM增菌液，43℃微需氧培養(yǎng)48h。
（4）分離培養(yǎng)
將上述增菌液分別接種于下列平板培養(yǎng)。①堿胨水-四號瓊脂平板和TCBS平板，36℃培養(yǎng)24h。②SC增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養(yǎng)24h。③GN增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培養(yǎng)24h。④腸道菌增菌肉湯-SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板，36℃培養(yǎng)24h。⑤氯化鈉結(jié)晶紫增菌液-TCBS平板，36℃培養(yǎng)24h。⑥7.5%氯化鈉肉湯-血瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24h。⑦改良PBS-NYE平板和麥康凱平板，分別在22℃和36℃培養(yǎng)48h。⑧CEM增菌液-Camp-BAP血瓊脂平板、Skirrow血瓊脂平板，43℃微需氧培養(yǎng)48h。
（5）菌落形態(tài)觀察
①普通瓊脂平板36℃培養(yǎng)24h后平板上生長形成中等大小、無色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。②血瓊脂平板36℃培養(yǎng)24h后平板上生長形成中等大小、白色、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。③SS平板、麥康凱平板和EMB平板36℃培養(yǎng)24h后平板上分別生長形成中等大小、無色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。④HE平板36℃培養(yǎng)24h后平板上生長形成中等大小、綠色透明、濕潤、邊緣整齊、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形態(tài)一致。⑤SS平板、麥康凱平板和EMB平板在36℃培養(yǎng)48h后菌落發(fā)生變化:SS平板、EMB平板的菌落變粉紅色;麥康凱平板上的菌落變灰白色，并形成粗糙形菌落。
（6）染色鏡檢
各挑取普通瓊脂平板、血平板、SS平板、HE平板、麥康凱平板和EMB平板上單個菌落，染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)革蘭陰性的短小桿菌，菌體形態(tài)一致。
（7）純培養(yǎng)及初步生化試驗
挑取各平板上的單個菌落接種于三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體，36℃培養(yǎng)24h。每個平板挑取5個菌落分別接種5支三糖鐵瓊脂、挑取5個菌落分別接種五支葡萄糖半固體，防止漏檢。觀察可見所有三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物均發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵乳糖、蔗糖;所有葡萄糖半固體培養(yǎng)物發(fā)酵葡萄糖、產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、沿穿刺線生長、無動力。
（8）氧化酶試驗
挑取各平板培養(yǎng)物、三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)物做氧化酶試驗:均為陰性。
（9）血清學(xué)分型
根據(jù)該菌的培養(yǎng)特性、營養(yǎng)要求、菌落形態(tài)和菌體形態(tài)特征及初步生化試驗、氧化酶試驗結(jié)果，挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做下列玻片凝集試驗，觀察結(jié)果。
志賀菌4種多價診斷血清:凝集;宋內(nèi)志賀菌血清:凝集;宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相血清:凝集。其中有1支從GN增菌液分離到SS平板再接種到三糖鐵瓊脂上的三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物，志賀菌4種多價診斷血清不凝集;將菌液煮沸后再做玻片凝集試驗，仍然不凝集;用鮑氏多價1、2、3分別檢查，也不凝集;用痢疾志賀菌3～12型多價血清檢查，也不凝集;將此三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)后，再做玻片凝集試驗。志賀菌4種多價診斷血清:凝集;福氏志賀菌多價血清:凝集;福氏志賀菌2型血清:凝集;福氏志賀菌群3，4因子血清:凝集;
（10）進一步生化反應(yīng)
志賀菌屬血清凝集的細菌，還需用生化試驗進一步確認，防止診斷血清出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。
①挑取三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)物進行下列生化試驗，觀察結(jié)果。
表1 宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物生化試驗
注:“+”為陽性;“-”為陰性
表2 福氏志賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物生化試驗
注:“+”為陽性;“-”為陰性
②挑取三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)物進行下列生化分群試驗，觀察結(jié)果。
表3 宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相血清凝集的三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物生化試驗
注:“+”為陽性;“-”為陰性
表4 福氏志賀菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖鐵瓊脂培養(yǎng)物生化試驗
注:“+”為陽性;“-”為陰性
③鑒定結(jié)果 檢出宋內(nèi)志賀菌Ⅰ相和福氏志賀菌2a型。
三、討論
1、對未知菌株的鑒定，一般可以采用下列順序直接涂片鏡檢、增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、菌落和菌體觀察、純培養(yǎng)、生化反應(yīng)試驗和血清學(xué)鑒定、藥物敏感性試驗和動物實驗。藥物敏感性實驗和動物實驗按菌株鑒定要求做。本例比對考核由于該樣品為凍干粉劑菌株，無法直接涂片鏡檢，必須先進行復(fù)蘇培養(yǎng)、增菌培養(yǎng)、接種平板后才能鏡檢。
2、鑒定菌株的首要條件是將菌株進行純培養(yǎng)對分離培養(yǎng)物進行菌落觀察和鏡檢觀察菌體形態(tài)，只有菌落形態(tài)和菌體形態(tài)都一致時，才能進行純培養(yǎng)和鑒定，否則還須繼續(xù)分純。挑取菌落形態(tài)和菌體形態(tài)都一致的可疑菌落進行純培養(yǎng)，然后再對純菌株進行一系列的鑒定。進行純培養(yǎng)時，當(dāng)需要細菌數(shù)量較多時，應(yīng)用分離平板進行純培養(yǎng);若只需少量細菌，可用三糖鐵瓊脂進行純培養(yǎng)，并可同時觀察初步生化反應(yīng)。由于某些菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間的菌落形態(tài)及菌體形態(tài)相似，進行純培養(yǎng)時，應(yīng)在同一平板上多挑幾個單個菌落進行純培養(yǎng)，防止不同菌屬之間或同菌屬不同菌型的細菌之間出現(xiàn)漏檢。
3、有條件的單位可以使用自動化鑒定系統(tǒng)，既可以大大縮短檢驗時間又可以節(jié)省大量的工作量。自動化鑒定雖然還不是國家標(biāo)準方法，但其結(jié)果可以作為未知菌株鑒定的參考。
4、質(zhì)量控制。整個檢驗過程注意無菌操作，使用空白對照，陰、陽性對照，可以保證試驗的成功;染色液、培養(yǎng)基、試劑、診斷血清等要在有效期內(nèi)使用，并且要用已知參考菌株進行測試;選用合適的鑒定系統(tǒng)，并將分離菌株與相關(guān)的參考菌進行比較，可以有效保證實際應(yīng)用鑒定系統(tǒng)。