一、背景
真菌總蛋白質(zhì)微量提取試劑盒適用于從各種大型真菌（蕈菌）類樣本中提取總蛋白。試劑盒組分針對厚細胞壁樣本進行優(yōu)化，提取過程簡單方便，可在1小時內(nèi)完成。該試劑盒含有的蛋白酶抑制劑混合物，阻止了蛋白酶對蛋白的降解，為提取高純度的蛋白提供了保證。提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫共沉淀等下游蛋白研究。
真菌總蛋白質(zhì)微量提取試劑盒專門用于快速提取微量真菌蛋白用于SDS-PAGE凝膠電泳和Western印跡分析。本產(chǎn)品結(jié)合玻璃珠破壁和化學(xué)法破壁兩種方法,適合于各種形態(tài)的各種酵母材料。
本產(chǎn)品的其主要特點是：
1、破壁效率高,能達到80-90%。
2、可以處理各種酵母樣品。
3、操作簡單,得到的裂解液可以直接用于SDS-PAGE和Western印跡分析。
使用方法：
1、提取液制備：每500μl冷的真菌蛋白提取液中加入2μl蛋白酶抑制劑混合物，4μl蛋白穩(wěn)定劑，混勻后置冰上備用。
2、取100mg組織樣本剪碎①，置于研缽中用液氮研磨。(沒有液氮研磨條件也可直接加入提取液后置冰上研磨即可)
3、研磨后加入500μl真菌蛋白提取液。
4、混勻后，在4℃條件下振蕩20-30分鐘。
5、在4℃，14000rpm條件下離心10分鐘。
6、快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到真菌總蛋白。
7、將上述蛋白提取物定量②后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?br />
二、應(yīng)用
用于溫度對深黃被孢霉M6-22蛋白質(zhì)表達譜的影響研究：
蛋白的提取是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的首要步驟,其質(zhì)量的好壞直接影響蛋白質(zhì)表達分析研究的開展及其結(jié)果的準確性。為了從深黃被孢霉M6-22中提取細胞總蛋白質(zhì)并進一步進行蛋白組學(xué)等一些相關(guān)研究,采用五種已報道的蛋白質(zhì)提取方法分別提取深黃被孢霉M6-22的總蛋白質(zhì),以蛋白質(zhì)濃度和SDS-PAGE結(jié)果相結(jié)合的方法比較提取方法。
結(jié)果顯示,其中一種方法提取的蛋白質(zhì)濃度相對較高而且蛋白質(zhì)條帶豐度最高,進一步對該方法進行了改良,所獲得蛋白質(zhì)的濃度可達約2.99 mg/ml。改進后的方法操作步驟簡單,蛋白質(zhì)條帶豐度更高。采用改進后的方法提取其他五種真菌的總蛋白質(zhì),結(jié)果顯示其對其他真菌也有很好的提取效果,說明可作為一種真菌總蛋白質(zhì)的高效提取方法。用改進后的方法分別提取28℃和15℃培養(yǎng)的深黃被孢霉M6-22的總蛋白質(zhì),先經(jīng)過透析除鹽以降低鹽份對第一向等電聚焦的影響,透析后的樣品利用雙向電泳技術(shù)分析兩個溫度下蛋白質(zhì)表達譜的差異性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)總共出現(xiàn)了111個差異變化的蛋白質(zhì),其中15℃上調(diào)的蛋白質(zhì)有69個,15℃下調(diào)的蛋白質(zhì)有42個,這些上調(diào)變化的蛋白質(zhì)中有7個蛋白質(zhì)只在15℃培養(yǎng)時才會表達,在15℃培養(yǎng)條件下沒有出現(xiàn)表達抑制而消失的蛋白質(zhì)。
選擇61個分子量較小、差異比值為2倍以上蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜分析,成功的鑒定出41個蛋白質(zhì)。將鑒定成功的蛋白質(zhì)通過GO聚類分析進行功能的聚類,以分子功能為依據(jù)可以將差異性的蛋白質(zhì)分為水解酶、轉(zhuǎn)移酶、連接酶、ATP結(jié)合蛋白、GTP結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白和假定蛋白等;以生物學(xué)途徑為依據(jù)可以將差異性的蛋白質(zhì)分為細胞組件合成、糖代謝、核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、有機酸代謝、蛋白質(zhì)翻譯和修飾、轉(zhuǎn)錄、運輸和自我吞噬等相關(guān)的生命途徑;以細胞組件為依據(jù)可以將差異性的蛋白質(zhì)分為細胞膜、細胞器、細胞質(zhì)、細胞核、細胞骨架等細胞組件。對聚類后的蛋白質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)深黃被孢霉對低溫的響應(yīng)涉及多個分子機理和生理代謝的網(wǎng)絡(luò)綜合響應(yīng),這對于人們從分子水平特別是蛋白質(zhì)組水平認識深黃被孢霉以及絲狀真菌的低溫適應(yīng)機制提供了一定的理論基礎(chǔ)。
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