一、背景
原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以內(nèi)的細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究，如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株（系）研究、DNA，RNA和遺傳學(xué)研究等，還可應(yīng)用于當(dāng)今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用，市場前景廣闊。
原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和器官后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此，較為嚴(yán)格地說是指成功傳代之前的培養(yǎng)，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì)，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上，通常把第一代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。
最常用的原代細(xì)胞的培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。
組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng)。
分散細(xì)胞培養(yǎng)大致步驟為：將動(dòng)物組織從機(jī)體中取出離散成單個(gè)細(xì)胞(常用胰蛋白酶)，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖(注意整個(gè)過程無菌)。
二、應(yīng)用
原代細(xì)胞可以用于瓦氏雅羅魚鰓、腸組織及原代細(xì)胞在堿脅迫下的鈣調(diào)蛋白表達(dá)機(jī)制研究：
以耐高堿自然優(yōu)勢種瓦氏雅羅魚(Leuciscus waleckii)作為研究對(duì)象,建立魚體鰓、腸細(xì)胞的原代及傳代培養(yǎng)體系,探究堿脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細(xì)胞的增殖能力及功能的影響,同時(shí)分析了鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CAM)在鰓、腸組織及細(xì)胞中的表達(dá)情況,從而在瓦氏雅羅魚堿耐受機(jī)制角度達(dá)到對(duì)鈣調(diào)蛋白作用機(jī)理的初步分析?；诖?本研究主要評(píng)估了瓦氏雅羅魚鰓、腸細(xì)胞對(duì)急、慢性堿耐受性及鰓、腸組織的生長發(fā)育狀態(tài),觀察了堿脅迫下瓦氏雅羅魚血清中Ca2+含量,從而對(duì)鈣調(diào)蛋白的基因表達(dá)量變化進(jìn)行生理到組織再到細(xì)胞的多層次解讀。
本研究采用胰蛋白酶消化法和密度梯度離心法對(duì)鰓、腸細(xì)胞進(jìn)行分離、純化后,將細(xì)胞懸液均分置于DMEM(Dulbecco’s Modified Eagles Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)和L-15(Leibovitz Medium)三種培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。在該過程中,分時(shí)段分別采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定細(xì)胞增殖數(shù),用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定細(xì)胞增殖率;同時(shí),對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞來源和活性鑒定,分析原代鰓、腸細(xì)胞的生長狀態(tài)。
1、通過對(duì)兩細(xì)胞系進(jìn)行長期培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察后發(fā)現(xiàn):瓦氏雅羅魚鰓、腸細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)采用DMEM培養(yǎng)基可獲得穩(wěn)定、良好的培養(yǎng)效果,細(xì)胞生長狀態(tài)顯著優(yōu)于L-15和MEM;啟動(dòng)原代培養(yǎng)的36-72 h,鰓、腸細(xì)胞生長代謝旺盛,其增殖規(guī)律符合經(jīng)典“S”生長曲線;利用鈣調(diào)蛋白camk2g2基因(Locus Tag Prefixes:J5810)可在全身表達(dá)的特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定后證實(shí)：兩細(xì)胞確系分離自瓦氏雅羅魚。
2、堿脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚鰓、腸細(xì)胞活性及功能的影響為探討堿脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細(xì)胞活性及功能的影響,本研究建立瓦氏雅羅魚鰓、腸細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,采用NaHCO3作為主要耐受因素。實(shí)驗(yàn)過程如下:加入10 mmol/L NaHCO3的新鮮DMEM培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h、2 h、3 h、4 h、5 h后收集在660 nm(雙波長法)處檢測其吸光值,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線確定波動(dòng)范圍以方便后續(xù)堿梯度實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定。
隨后根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果:設(shè)置NaHCO3濃度梯度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、25、50和75 mmol/L對(duì)鰓、腸細(xì)胞系進(jìn)行耐受,然后將其放入CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后,采用CCK-8法檢測兩細(xì)胞活性和存活率;DNA Ladder法測定鰓、腸細(xì)胞細(xì)胞凋亡及壞死情況,從而分析細(xì)胞生長代謝狀態(tài)。結(jié)果顯示:瓦氏雅羅魚鰓、腸細(xì)胞的最佳耐受時(shí)長為3h,耐受NaHCO3的最佳濃度為25～50 mmol/L;該條件下孵育的鰓、腸細(xì)胞均出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征。上述實(shí)驗(yàn)表明:瓦氏雅羅魚體外培養(yǎng)鰓、腸細(xì)胞可耐受25～50 mmol/L NaHCO3高濃度堿生境,且該生存條件對(duì)兩細(xì)胞系的功能及活性皆可造成不同程度的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
3、鈣調(diào)蛋白對(duì)瓦氏雅羅魚鰓、腸組織及細(xì)胞功能的影響本部分實(shí)驗(yàn)分為組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)兩個(gè)層次。
體外實(shí)驗(yàn):以瓦氏雅羅魚原代鰓、腸細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,選取3個(gè)NaHCO3濃度(0、25和50 mmol/L)進(jìn)行梯度耐受,經(jīng)3 h孵育后通過測定原代細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+含量、camk2g2基因、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵基因xbp1u與氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)鍵基因gsr表達(dá)量,來探討離體條件下堿脅迫對(duì)瓦氏雅羅魚鈣調(diào)蛋白camk2g2的影響,并在細(xì)胞層面上探究該作用機(jī)制與非生物脅迫因子應(yīng)激響應(yīng)機(jī)制之間的潛在關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示：3 h堿耐受條件下,camk2g2在25 mmol/L NaHCO3耐受的鰓細(xì)胞中出現(xiàn)極顯著表達(dá)(<0.01),50 mmol/L NaHCO3耐受的鰓細(xì)胞中則出現(xiàn)顯著性上升(<0.05),但camk2g2在腸細(xì)胞中的表達(dá)量雖然隨著堿度的增加而增加,但未見顯著差異(>0.05)。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務(wù),是中國微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！