一、背景
小鼠胰腺Β細(xì)胞含SV40大T抗原，適用于轉(zhuǎn)染，源于10周雌性小鼠。
二、小鼠胰腺Β細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇小鼠胰腺Β細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)小鼠胰腺Β細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠胰腺Β細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
小鼠胰腺Β細(xì)胞可以用于Exendin-4對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠胰腺β細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制研究：
探討NF-κB-iNOS-NO信號(hào)通路在第三丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)誘導(dǎo)小鼠胰腺β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞凋亡中的作用;在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡的作用及其可能的機(jī)制。
方法：選用小鼠β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞為研究對(duì)象,用t-BHP誘導(dǎo)刺激,模擬體外β細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷后的細(xì)胞凋亡模型,通過(guò)MTT觀察t-BHP作用后細(xì)胞的存活率;AO-EB染色熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài),Annexin-Ⅴ-PI染色流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率,Griess化學(xué)顯色法檢測(cè)氧化損傷過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)水平,同時(shí)應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)胞漿誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)蛋白、胞漿及胞核核因子-κB片斷p65(NF-κB p65)蛋白表達(dá)水平的變化。
在此基礎(chǔ)上,分別應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、iNOS抑制劑左旋硝基精氨酸甲酯(NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester,L-NAME)預(yù)處理并檢測(cè)上述指標(biāo),以明確NF-κB-iNOS-NO信號(hào)通路在t-BHP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡中的作用;隨后用不同濃度(10,100 nmol/L)的Exendin-4預(yù)處理,觀察Exendin-4對(duì)t-BHP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,并進(jìn)一步研究Exendin-4能否通過(guò)NF-κB-iNOS-NO通路影響t-BHP誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞發(fā)生凋亡性損傷。
結(jié)果：MTT顯示tBHP(12.5200μmol/L)作用不同時(shí)間后可明顯抑制MIN6細(xì)胞的生長(zhǎng),并呈現(xiàn)一定的時(shí)效和量效關(guān)系;AO-EB熒光顯微鏡及Annexin-Ⅴ-PI雙染流式細(xì)胞檢測(cè)證實(shí)25μmol/L濃度的tBHP處理60min后,誘導(dǎo)β細(xì)胞的損傷作用以凋亡為主,而更高濃度的tBHP使細(xì)胞由凋亡轉(zhuǎn)向壞死。25μmol/L tBHP處理60min后同時(shí)引起細(xì)胞NO水平明顯升高;該濃度的tBHP處理30min時(shí)胞漿iNOS蛋白達(dá)高峰水平;而該濃度的tBHP作用20min時(shí)胞核NF-κB活化片斷p65蛋白達(dá)高峰水平;iNOS抑制劑L-NAME(500μmol/L)或抗氧化劑NAC(10mmol/L)預(yù)處理均可明顯抑制tBHP誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡及NO水平的增高。不同濃度的Exendin-4預(yù)處理預(yù)處理18h同樣抑制tBHP誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡及NO水平的增高,并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,并且Exendin-4能抑制tBHP誘導(dǎo)的β細(xì)胞胞核NF-κB p65及胞漿iNOS蛋白的表達(dá)水平。
結(jié)論：
(1)t-BHP可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡性損傷,在此過(guò)程中伴隨細(xì)胞內(nèi)NO水平的增加;
(2)氧化應(yīng)激-NF-κB-iNOS-NO-凋亡通路可能是t-BHP誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的重要通路之一;
(3)GLP-1受體激動(dòng)劑Exendin-4可以劑量依賴性地抑制t-BHP誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡,同時(shí)抑制細(xì)胞NO水平;
(4)Exendin-4可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化、胞漿iNOS表達(dá)水平來(lái)抑制NO水平,最終減輕氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。Exendin-4在胰腺β細(xì)胞保護(hù)治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
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