一、背景
犬皰疹病毒PCR試劑盒是一種用于快速檢測和定量犬皰疹病毒的分子生物學(xué)檢測試劑盒。
該試劑盒采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，通過一對引物介導(dǎo)，可以在動植物體外對特定基因（DNA）片段進行快速酶促擴增。經(jīng)過n個熱循環(huán)擴增后，擴增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n倍，使得檢測擴增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。
犬皰疹病毒PCR試劑盒具有特異性強、靈敏度高、快速高效等優(yōu)點。該試劑盒的特異性取決于引物與模板DNA的特異正確結(jié)合以及堿基配對原則等。
此外，該試劑盒是針對犬皰疹病毒設(shè)計的，因此在其他動物或環(huán)境中檢測到的結(jié)果可能不準(zhǔn)確。
二、犬皰疹病毒PCR試劑盒實驗操作
1、模板制備（樣本制備區(qū)）
建議使用配套水生動物病害基因組DNA/RNA提取試劑盒系列產(chǎn)品，具體過程詳見產(chǎn)品說明書。
2、添加模板（模板添加區(qū)，放置于冰盒中進行）
請于-20℃條件下保存，有效期12個月
取出所需測試數(shù)的已含有反應(yīng)液A-TSV-I的PCR管，將試劑完全解凍，離心30秒，在管蓋上標(biāo)記管名（陰性對照管NG、樣品XX、陽性對照管PG）。打開管蓋向各管管底分別加入0.8μL B-I及0.2μL R-I，蓋上陰性對照管管蓋，其他各管分別沿管壁加入2μL模板，順序為待測樣品模板、PG-TSV-I，依次蓋好各管管蓋，離心30秒，立即進行擴增反應(yīng)。
3、擴增反應(yīng)（擴增及產(chǎn)物分析區(qū)）
①恒溫儀器63℃條件下反應(yīng)60 min。待儀器升溫至63℃后，新建程序，設(shè)置實驗名稱及反應(yīng)時間，將步驟2中離心后的PCR反應(yīng)管放入恒溫?zé)晒夥肿訖z測儀，點擊開始檢測。
②若使用熒光定量PCR儀，則熒光基團選擇FAM，淬滅基團選擇None，將63℃15 s，63℃45 s作為一個循環(huán)，于63℃45 s處收集熒光信號，60個循環(huán)。
其他儀器請參照儀器說明書進行設(shè)置。
三、應(yīng)用
犬皰疹病毒PCR試劑盒可以用于犬皰疹病毒的分離鑒定及US6基因的生物信息學(xué)分析：
犬皰疹病毒(Canine herpesvirus,CHV)感染僅存在于犬中,是新生幼犬的急性、非發(fā)熱型致死性疾病。由US6基因編碼的gD糖蛋白是皰疹病毒囊膜上的重要組成部分,它具有識別各自紅細胞的能力,使各個皰疹病毒都有自己的特征。因此,本研究根據(jù)自然發(fā)病犬的臨床癥狀、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)、病毒的分離和純化、動物回歸實驗和基因生物信息學(xué)分析的實驗手段證實了該疾病為CHV感染所致,另外,對US6基因編碼的gD糖蛋白的主要抗原區(qū)域進行分析并構(gòu)建了表達載體。
試驗結(jié)果如下：
1、從病犬肝臟中提取的DNA經(jīng)PCR擴增,檢測出大小為357 bp的目的條帶,經(jīng)NCBI的Blast比對驗證該病毒為CHV,毒株命名為CHV-JX株,并測得該病毒的TCID50為10-4.39/0.1mL;該病毒感染的犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)在電鏡下可看到圓形的病毒粒子,細胞出現(xiàn)了空泡化;在顯微鏡下,可以看到24h內(nèi)細胞開始出現(xiàn)圓縮、變暗,逐漸向周圍擴散,最后細胞脫落。將CHV-JX毒株接種到15日齡的幼犬,腹部皮膚可見皰疹,解剖見腎臟出現(xiàn)壞死灶等典型性的皰疹病毒臨床癥狀和病理變化。
2、與對照組相比,除24h組外,48h和96h組細胞的凋亡率顯著升高(P<0.05);與對照組相比,細胞線粒體膜電位在第24h、48h和96h時均極顯著升高(P<0.01);與對照組相比,細胞的ROS在24h時先升高,48h,72h,96h時下降;與對照組相比,除24h組外,其他組細胞的pH均下降。
3、經(jīng)PCR擴增得到條帶(大小為1200 bp左右)的US6全基因與國內(nèi)外CHV毒株的US6基因進行同源性分析,與澳大利亞、英國和美國犬CHV的核苷酸同源性結(jié)果高達99.9%,同時氨基酸同源性為100%,然而它與非犬源CHV毒株的同源率很低。DNA序列分析得出該基因編碼346個氨基酸,使用全基因合成的方法合成該基因片段,并克隆到表達載體pET32a(+)上,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒CHV-3F-3R。獲得的犬源皰疹病毒CHV-JX感染犬后,生殖器官周圍可見典型的皰疹病毒臨床癥狀;CHV-JX感染MDCK后可導(dǎo)致細胞的凋亡;同時成功構(gòu)建了該病毒US6基因的主要抗原區(qū)域的重組質(zhì)粒。
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